基于網絡藥理學與分子對接探討補陽還五湯治療黃韌帶肥厚的分子機制*

張馳，鐘益梁，秦百君，陳鋒

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011； 2.贛州市贛縣區人民醫院，江西 贛州 341100；3.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200

退行性腰椎管狹窄癥(degenerative lumbar spinal stenosis，DLSS)是指由于關節突關節增生、椎間盤突出、黃韌帶肥厚(ligamentum flavum hypertrophy，LFH)等因素造成椎管及神經根管狹窄，以腰腿痛、間歇性跛行為主要臨床表現的病癥。DLSS的綜合患病率為11%，隨著年齡的增長，DLSS患病率逐漸提升[1]。在我國人口老齡化發展態勢下，DLSS已成為導致中老年人腰腿痛、下肢無力、行動受限的常見骨科疾病[2]，對中老年人群的生活質量影響較大。目前，臨床主要通過手術治療DLSS，但費用較昂貴，且手術存在一定的風險。治療DLSS的藥物以抗炎、鎮痛類為主，能在短期內改善DLSS相關癥狀，但長期用藥會帶來不良反應[3]。尋找安全有效的治療藥物并探討其作用機制成為DLSS研究中亟待解決的問題。

LFH在DLSS發生發展中占據重要地位，本課題組前期研究收集了核磁共振影像表現為LFH的DLSS病例[4]，術中摘取的黃韌帶組織病理學表現為彈力纖維顯著減少，排列紊亂，膠原纖維增多，呈現典型的纖維化改變[5]。中醫認為，纖維化疾病主要由于氣虛推動無力，血行滯澀，久而停積成瘀[6]。DLSS中醫臨床實踐指南將氣虛血瘀證列為DLSS的主要證候之一，治法為補氣活血、化瘀止痛，組方用補陽還五湯[3]。補陽還五湯在多種纖維化疾病中均表現出較好的抗纖維化作用[6]，體現了中醫學“異病同治”的特點，但由于成分復雜、作用靶點不明確，藥效分子機制仍需進一步研究。因此，本研究通過網絡藥理學聯合基因芯片與分子對接技術，初步研究補陽還五湯治療LFH的潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 篩選差異基因與疾病靶點從GEO數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gds/)下載LFH相關的基因數據集GSE113212的矩陣和平臺注釋數據，該芯片數據來源于4份老年患者的LFH標本和4份年輕患者的非LFH標本。采用Perl 5.30.0軟件整理、注釋矩陣數據，采用R 4.1.2軟件的limma軟件包執行差異分析，以logFC的絕對值>0.8且P<0.05篩選差異基因，并繪制火山圖和熱圖。基于Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)將LFH差異基因轉化為蛋白名，統一通用名稱，刪除非人源蛋白后作為LFH疾病靶點。

1.2 篩選補陽還五湯的有效成分和藥效靶點登陸中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SymMap數據庫(http：//www.symmap.org/)檢索黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁的化合物成分，以口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18篩選補陽還五湯的有效成分，并收集藥效靶點，通過Uniprot數據庫校對靶點蛋白，統一通用名稱，刪除非人源蛋白。

1.3 篩選補陽還五湯治療LFH的靶點采用Venny 2.1平臺將補陽還五湯藥效靶點與LFH疾病靶點取交集，獲得補陽還五湯治療LFH的靶點。并采用Cytoscape 3.7.0軟件構建“中藥-化合物-靶點”可視化網絡。

1.4 構建蛋白互作網絡將補陽還五湯治療LFH的靶點輸入至String數據庫(https：//cn.string-db.org/)。以互作分數≥0.4作為篩選閾值，構建蛋白互作網絡。采用Cytoscape 3.7.0軟件的CytoNCA插件分析網絡中蛋白靶點的Closeness Centrality、Betweenness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method和Network Centrality共6個參數，計算中位值，將上述參數均>中位值的靶點判定為網絡中的核心蛋白[7]。

1.5 通路富集分析采用R 4.1.2軟件分析，以P<0.05篩選補陽還五湯治療LFH靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路[8]，并將富集顯著性排名前10位的生物學進程、細胞組分、分子功能以及富集顯著性排名前40位的信號通路可視化展示。選取富集基因數不少于5個的信號通路，采用Cytoscape 3.7.0軟件的ClueGO和CluePedia插件聚類分析[9-10]，并通過可視化網絡展示通路上的靶點。

1.6 分子對接驗證化合物成分與靶點的結合關系從TCMSP數據庫下載化合物成分的化學結構，從PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)獲取靶點蛋白的結構。采用Pymol 1.8.0軟件去除蛋白晶體的水分子、離子和配體后，將蛋白結構導入AutoDockTools 1.5.6軟件尋找活性口袋，蛋白和化合物文件經格式轉換后通過AutoDock Vina軟件執行分子對接模擬分析[11]，當結合能<-5.0 kcal·mol-1則判定為結合活性較好，結合能<-7.0 kcal·mol-1則判定為結合活性很強[12]。

2 結果

2.1 LFH的差異基因與疾病靶點共篩選出 1 851 個LFH的差異基因，其中有1 150個上調基因和701個下調基因，數據經R 4.1.2軟件可視化展示排名前60位的差異基因熱圖(圖1A)及全部差異基因的火山圖(圖1B)。上述差異基因經Uniprot數據庫校對，篩除非人源靶點后，得到1 659個LFH疾病靶點。

注：A為差異基因熱圖，B為差異基因火山圖，其中紅色、綠色和黑色條帶及點分別代表LFH組相對高表達、相對低表達和表達差異不顯著的基因

2.2 補陽還五湯治療LFH的調控網絡根據口服生物利用度和類藥性篩選得到105個補陽還五湯的化合物成分，其中黃芪20個，當歸2個，赤芍29個，地龍2個，川芎7個，紅花22個，桃仁23個。共收集到264個補陽還五湯的藥效靶點，與1 659個LFH疾病靶點取交集后得到50個治療靶點(圖2)。經整理歸納“中藥-化合物-靶點”關聯，最終得到補陽還五湯治療LFH的調控網絡，其中包含黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁共7味中藥，涉及41種化合物成分，50個治療靶點(圖3)。

圖2 補陽還五湯藥效靶點與LFH疾病靶點韋恩圖

注：紅色線條代表中藥與化合物的關聯，藍色線條代表化合物與靶點的關聯

2.3 補陽還五湯治療LFH的靶點蛋白互作網絡將50個治療靶點導入String數據庫分析，通過Cytoscape 3.7.0軟件可視化，剔除游離靶點后，得到由47個蛋白組成的網絡，共有288條蛋白互作關系。根據6種參數的中位值篩選后得到14個核心蛋白靶點，分別為過氧化氫酶(catalase，CAT)、去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、CTNNB1、CXCL8、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、HIF1A、PPARG、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、CAV1、IGFBP3(圖4)。

注：圖中橙色圓點代表核心蛋白靶點，紫色圓點代表普通蛋白靶點

2.4 補陽還五湯治療LFH靶點涉及的功能和通路GO功能富集分析共得到1 720條功能，其中生物學進程1 632條，包括成纖維細胞增殖的調節、慢性炎癥反應、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號的調節、細胞對TGF-β刺激的反應等；細胞組分38條，包括纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、含膠原細胞外基質等；分子功能50條，包括生長因子結合、Smad綁定、信號受體激活劑活性等(圖5A)；KEGG通路富集分析結果包含104條通路，分別為叉頭轉錄因子(forkhead transcription factors of Oclass，FOXO)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tranions，JAK/STAT)信號通路、腺苷一磷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK)信號通路等(圖5B)。進一步聚類分析將信號通路分為6個大類，FOXO信號通路作為其中一個大類，包含9個富集基因，分別為CAT、CCND1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)、EGFR、IL-10、IL-6、SIRT1、溶質載體家族2成員4(solute carrier family 2 member 4，SLC2A4)、TGF-β1(圖6)。

圖5 補陽還五湯治療LFH靶點的功能和通路富集分析氣泡圖

注：三角形節點代表信號通路，每種顏色代表一個聚類組別；圓形節點代表富集在通路上的基因

2.5 補陽還五湯的化合物成分與FOXO信號通路靶點的結合活性從“中藥-化合物-靶點”調控網絡(圖3)中梳理富集在FOXO信號通路的9個靶點及相關聯的化合物成分，通過分子對接分析化合物與靶點的結合活性。由于PDB數據庫中未查到SLC2A4蛋白結構，故無法對該蛋白執行分子對接。17對“化合物-靶點”關聯均得到分子對接的驗證，具有較好的結合活性，其中TGF-β1、CDKN1A、EGFR、CAT、SIRT1與補陽還五湯化合物成分的結合活性很強(表1，圖7)。紅花、桃仁、當歸、赤芍的共有化合物成分beta-sitosterol與TGF-β1的結合活性是所有對接結果中最強的。

注：圖中央的棍棒結構為化合物配體，周圍的螺旋條帶為蛋白結構，展現了化合物配體與蛋白的分子對接空間構象，每幅圖片上方文字標注為化合物配體與蛋白的名稱

表1 補陽還五湯的化合物成分與FOXO信號通路富集靶點的分子對接信息

3 討論

中醫將DLSS歸屬為“痹證”“腰腿痛”等范疇，病因主要為先天腎氣虧虛、后天脾虛運化無力。氣虛則督脈經氣弱，腰脊失養，瘀血內停，引發肌肉、韌帶、關節等退變失穩，壓迫椎管及神經根管引發腰腿痛、間歇性跛行等癥狀。糾正氣虛血瘀之因才能夠使督脈通達，脊柱氣血經絡順暢，則血瘀病理產物得以疏散排出。補陽還五湯的組方應用出自《醫林改錯》，功效為補氣活血通絡。本方重用生黃芪為君藥，甘溫補脾、肺之氣，氣為血之帥，故氣旺可促血行，瘀去則絡通。當歸尾為臣藥，活血通絡且不傷血。赤芍、桃仁、紅花、川芎為佐藥，助當歸尾活血祛瘀。地龍為佐使藥，其藥性力專善走，活絡通經，引諸藥之力匯達絡中。臨床應用補陽還五湯能夠顯著改善DLSS患者的疼痛癥狀，增加無痛行走距離[13-14]，降低血清炎癥因子水平[15-16]。王寶劍[17]認為，炎癥和纖維化是LFH的主要病理因素，在臨床樣本和動物模型的LFH組織中發現炎性因子 IL-1β、TNF和纖維化相關因子COL1A1、COL3A1高表達，通路關鍵節點TGF-β1、p-Smad2/3高表達。本研究分析發現，補陽還五湯的化合物成分能夠直接作用于TNF、COL1A1、COL3A1和TGF-β1以及其他炎性因子IL-6、IL-10、MMP1等，其中TNF、TGF-β1、IL-6、IL-10為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點。臨床采用補陽還五湯加減聯合溫針灸治療DLSS能降低血清TNF和IL-6水平[15]，說明補陽還五湯具有一定的抗炎作用。

此外，本研究發現補陽還五湯治療LFH的靶點富集在FOXO信號通路、PI3K/Akt信號通路等。其中，去乙酰化酶SIRT1為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點，在FOXO信號通路的乙酰化調控機制中占有重要地位，其能夠將轉錄因子FOXO去乙酰化，從而促進下游靶基因的轉錄。心肌肥厚大鼠模型的研究證實，肥厚的心肌組織中SIRT1表達降低，FOXO1乙酰化水平以及TNF、IL-1β、IL-6、COL1A1、α-SMA蛋白表達增高，姜黃素和葛根素能夠通過上調SIRT1抑制心肌纖維化和炎癥反應，從而改善心肌肥厚和心臟功能，而SIRT1抑制劑能夠逆轉上述效應[18-19]。心肌肥厚與LFH的病理特點相類似，本研究的基因芯片結果發現LFH組的SIRT1呈現異常低表達(logFC=-1.032，P=0.011)，分子對接結果中補陽還五湯的化合物成分formononetin與SIRT1的結合能力很強，且已有實驗證實formononetin可通過激活SIRT1抑制炎癥和纖維化表型[20-21]，故formononetin可能通過SIRT1/FOXO軸調控炎癥與纖維化而發揮治療LFH的作用。

本研究發現，CCND1為補陽還五湯治療LFH的核心蛋白靶點，它與CDKN1A均為FOXO信號通路下游細胞周期相關的靶基因。我們通過基因芯片發現，LFH組的CCND1(logFC=1.001，P=0.006)和CDKN1A(logFC=1.016，P=0.003)呈現異常高表達。Gang等[22]研究發現，CDKN1A在人類風濕關節炎滑膜組織和成纖維細胞樣滑膜細胞中呈現異常低表達，過表達CDKN1A能顯著抑制該細胞的增殖和侵襲，并使細胞周期停滯在G0/G1期，同時下調TNF、IL-6的表達，上調IL-10的表達。上述結果與我們研究的LFH芯片表達結果相反，黃韌帶成纖維細胞中CDKN1A的功能有待新的實驗進一步論證。成纖維細胞為人體黃韌帶的主要效應細胞，能夠分泌膠原纖維和彈性纖維。在椎間盤退變、椎體序列不穩等因素產生的異常機械應力下，黃韌帶組織微損傷誘導瘢痕修復、炎癥細胞浸潤，炎性因子刺激膠原分泌型成纖維細胞增殖，黃韌帶中膠原纖維比例增多最終誘發LFH。魯齊林[23]研究發現，在外源性炎癥因子MIF刺激下，黃韌帶成纖維細胞周期分布中S期顯著增加，且CCND1表達升高，說明細胞增殖水平增加；成纖維細胞TGF-β1、MMP13、IL-1β、IL-6、TNF、COL1A1、COL3A1表達增加，說明炎癥水平和膠原表達水平增加，Rho途徑是該過程的中間環節，在膝關節囊成纖維細胞的體外研究中亦得出了相似的結論[24-25]。本研究發現，補陽還五湯的多個化合物成分與CCND1、CDKN1A有較好的結合活性，進一步說明補陽還五湯多成分、多靶點的復雜調控特點，可能通過調控成纖維細胞增殖治療LFH。關于FOXO的上游調控機制，p-Akt能夠促進FOXO1、FOXO3a磷酸化并使其進入泛素化降解進程，從而負性調控FOXO的轉錄活性[26-27]。此外，JAK/STAT信號通路[28]、AMPK信號通路[29]均為FOXO的上游調控途徑，在LFH的研究中有待于進一步探討。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學聯合基因芯片技術尋找補陽還五湯治療LFH的靶點，通過功能與通路富集分析、分子對接技術，結合相關文獻證據，初步發現補陽還五湯可能通過FOXO信號通路、PI3K/Akt信號通路和AMPK信號通路調控成纖維細胞增殖、炎癥和膠原合成，治療LFH從而改善DLSS的疾病進程。本研究結果能夠為進一步分析補陽還五湯治療LFH的分子機制提供方向。