基于TLR4/NF-κB通路研究穿心蓮內酯對腦出血大鼠急性期炎癥的影響*

姜燕強，陳俊麗，陳利平，段國華，張昆，劉亞利，劉英

武安市第一人民醫院，河北 武安 056300

腦出血是指非外傷所導致的腦實質出血，約占腦卒中患者的30%，急性期死亡率超過35%，且超過50%的存活患者將伴有終身殘疾，極大地威脅著患者的生命健康和生活質量[1]。病理學研究發現，腦出血初期即出現的炎性細胞浸潤將加重腦組織水腫和繼發性腦損傷，在腦出血疾病進展過程中發揮著重要作用。因此，抑制炎癥反應作為腦出血的治療靶點成為當前的研究熱點[2]。小膠質細胞為先天性免疫細胞，其在腦出血后最先被活化并分泌趨化因子、前列腺素等參與炎癥反應的調節，其中Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路發揮著重要的調控作用[3-5]。

中醫藥是具有獨特理論及技術方法的醫藥學體系，在腦出血治療領域逐漸得到關注與認可。腦出血在中醫屬于“中風”范疇，氣虛血瘀、痰瘀阻絡是其主要病機[6]。中藥穿心蓮是爵床科植物穿心蓮干燥地上部分，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，常用于急性菌痢、肺炎、氣管炎、胃腸炎等疾病的治療。穿心蓮內酯(andrographolide)是中藥穿心蓮的主要有效成分，具有良好的抗炎活性，能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路改善膿毒癥所致心肺組織炎癥、細菌性肺部炎癥[7-9]?；诖?，本研究探討穿心蓮內酯對腦出血大鼠急性期炎癥反應及TLR4/NF-κB通路的影響。

1 材料

1.1 實驗動物240只清潔級健康雄性SD大鼠，7周齡，體質量220～240 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(冀)2018-004，動物合格號：202004012。分籠飼養1周后進行實驗，飼養環境：溫度25 ℃，相對濕度60%～70%，光照黑暗各12 h交替，自由進食和飲水。本實驗經武安市第一人民醫院醫學倫理委員會審核批準(倫理批號：WASYY-KY-2020-013)。

1.2 藥物與試劑穿心蓮內酯膠囊(惠州市九惠制藥股份有限公司，批號：20191217)；尼莫地平膠囊(海南普利制藥股份有限公司，批號：200125)。伊文思藍(國藥集團化學試劑有限公司，批號：W20190418)；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒、HE試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：200130、200413、200105、191014)；TLR4抗體、NF-κB抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體、IgG二抗、2，2′-聯喹啉-4，4′-二甲酸二鈉(2，2′-biquinoline-4，4′-dicarboxylic acid disodium salt，BCA)、增強型化學發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-20595R、bs-20355R、bs-0061R、bs-0295G、D10616、C05-07004)。

1.3 儀器BN-51700型腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；100 μL微量注射器(上海安亭微量進樣儀器廠)；SpectraMax M3型多功能酶標儀(美國BioTek公司)；Allegra 21R型低溫離心機(美國Beckman公司)；EG1150型包埋機、CM1950型冰凍切片機(德國Leica公司)；SE300型蛋白質電泳儀(美國Hoefer公司)；VE186型轉膜儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥采用隨機數字表法將240只大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組和穿心蓮內酯低、中、高劑量組，每組40只。除假手術組外，其余組大鼠均參照文獻報道的自體血注射法制備腦出血大鼠模型[10]，具體如下：大鼠禁食禁水12 h后，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，經左側股動脈取血后俯臥位固定于腦立體定位儀下，沿正中切開頭皮和骨膜、暴露前囟，在中線右旁3.5 mm與前囟前 0.2 mm 交匯處鉆孔，通過微量注射器在腦基底節區(深度6 mm)以10 μL·min-1速度注射50 μL自身股動脈血，無菌骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合皮膚。大鼠清醒后，按照Zea-Longa評分標準進行神經功能評分：神經功能無缺損為0分；左側前肢不能完全伸展為1分；行走時向左側轉圈為2分；行走時向左側傾倒為3分；意識喪失為4分。當大鼠的Zea-Longa 評分≥2分時，即為造模成功[11]。造模完成后，尼莫地平組灌胃給予濃度2 g·L-1的尼莫地平溶液[12]，穿心蓮內酯低、中、高劑量組分別灌胃給予濃度5 g·L-1、10 g·L-1、20g·L-1的穿心蓮內酯溶液(根據人和大鼠藥物劑量換算公式，分別為0.5倍、1倍、2倍的人臨床劑量)，假手術組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，灌胃體積均為 5 mL·kg-1，每天1次，療程7 d。

2.2 采用改良神經功能缺損評分標準(modified neurological scoring standard，mNSS)進行神經功能缺失評分按隨機數字表法每組各取8只大鼠，對照mNSS評分標準對大鼠神經功能進行評分[13]，得分越高則說明神經功能缺失越嚴重。

2.3 采用多田公式計算腦血腫體積[12]大鼠神經功能缺損評分后以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，頸椎脫臼處死大鼠并迅速斷頭，剝取腦組織并置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，采用高速冷凍切片機以注射給藥針孔為中心連續切片(厚度0.5 mm)，血腫為暗紅色，檢測血腫最大層面互為垂直的最大橫徑和最大縱徑長度，然后根據多田公式計算腦血腫體積。

血腫體積(mm3)=(π/6)×最大橫徑(mm) ×最大縱徑(mm)×血腫層數×切片厚度(mm)

2.4 干濕比重法計算腦含水量按隨機數字表法各組另取8只大鼠，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，頸椎脫臼處死大鼠并迅速斷頭，剝取腦組織后采用生理鹽水沖洗并拭干，取去除小腦和腦干后的大腦和間腦，稱其質量為濕質量(W濕)，置于烘箱中100 ℃烘干至恒質量后稱其質量為干質量(W干)，計算腦含水量。

腦含水量=(W濕-W干)/W濕×100%

2.5 伊文思藍滲透法測定血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性按隨機數字表法各組另取8只大鼠，以4 mL·kg-1的體積尾靜脈注射2%伊文思藍溶液，1 h后以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，開胸暴露大鼠心臟，由左心室-右心耳通路由快到慢灌注300 mL生理鹽水后大鼠斷頭并剝取腦組織，切取右側半腦，研磨勻漿后加入質量體積比13的50%甲酰胺溶液，60 ℃ 孵育24 h后3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液，酶標儀檢測610 nm波長處的光密度值(optical density，OD)，用標準液繪制標準曲線，然后根據標準曲線計算腦組織伊文思藍含量，通過腦組織伊文思藍含量反映BBB通透性。

2.6 HE染色檢查腦組織病理學按隨機數字表法各組另取8只大鼠，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝取腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，通過高速冷凍切片機、以注射給藥針孔為中心連續切片(厚度4 μm)，按照HE染色試劑盒操作說明依步處理，通過光學顯微鏡觀察各組大鼠腦組織病理學改變。

2.7 ELISA法檢測腦組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平取各組剩余的8只大鼠，以 3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，經腹主動脈取血并1 500 r·min-1離心 5 min(離心半徑8 cm)，取血清。頸椎脫臼處死大鼠，迅速斷頭、在冰上剝取腦組織，取右腦注射給藥針孔周圍腦組織，剪碎后加入4 ℃ RIPA裂解液在冰上靜置30 min使其充分裂解，3 500 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液。參照ELISA試劑盒操作說明書，依步驟處理后通過酶標儀檢測腦組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

2.8 Western Blot檢測腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平取2.7制備的腦組織裂解溶液，4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min(離心半徑8 cm)后取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，沸水浴10 min使蛋白變性后分別取30 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳(120 V電壓50 min，80 V電壓40 min)分離蛋白，濕法轉PVDF膜后置于5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加TLR4(稀釋比例為11 000)、NF-κB(稀釋比例為11 000)、β-actin(稀釋比例為 12 000)抗體后4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL顯色，以目標蛋白條帶灰度值與內參(β-actin)條帶灰度值的比值計算目標蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯中、高劑量組和尼莫地平組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內酯高劑量組神經功能缺失評分、腦血腫體積顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1，表1。

表1 各組大鼠神經功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較

注：A：假手術組；B：模型組；C：穿心蓮內酯低劑量組；D：穿心蓮內酯中劑量組；E：穿心蓮內酯高劑量組；F：尼莫地平組

3.2 各組大鼠腦組織病理學改變HE染色發現，假手術組大鼠未見腦組織血腫，腦組織形態和結構未見異常；模型組大鼠可見血腫紅細胞，腦組織呈現明顯水腫，神經元數量減少、形態不規則、間隙增大，胞核固縮深染、大量炎性細胞浸潤等病理學改變；與模型組比較，穿心蓮內酯低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠腦組織病理學改變呈現不同程度的改善，且穿心蓮內酯高劑量組效果最佳。見圖2。

注：A：假手術組；B：模型組；C：穿心蓮內酯低劑量組；D：穿心蓮內酯中劑量組；E：穿心蓮內酯高劑量組；F：尼莫地平組

3.3 各組大鼠BBB通透性比較與假手術組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯中、高劑量組和尼莫地平組腦組織伊文思藍含量顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內酯高劑量組腦組織伊文思藍含量顯著降低(P<0.01)。見圖3、表2。

注：A：假手術組；B：模型組；C：穿心蓮內酯低劑量組；D：穿心蓮內酯中劑量組；E：穿心蓮內酯高劑量組；F：尼莫地平組

表2 各組大鼠腦組織伊文思藍含量比較

3.4 各組大鼠腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較與假手術組比較，模型組大鼠腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯中、高劑量組和尼莫地平組腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內酯高劑量組腦組織IL-6、TNF-α 含量顯著降低(P<0.05)，血清IL-6、TNF-α 及IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

3.5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較與假手術組比較，模型組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內酯中、高劑量組和尼莫地平組TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內酯高劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。見圖4、表4。

注：A：假手術組；B：模型組；C：穿心蓮內酯低劑量組；D：穿心蓮內酯中劑量組；E：穿心蓮內酯高劑量組；F：尼莫地平組

表4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達量比較

4 討論

腦出血是一種發病急且致殘、致死率高的腦血管疾病，目前臨床上主要采取外科手術結合血壓管理的治療方案，雖能挽救部分患者生命，但急性期死亡率和存活患者殘疾率仍居高不下。腦出血病理機制復雜，其中炎癥反應在腦出血急性期及繼發性腦損傷過程中發揮著重要作用[14]。

隨著中醫藥現代化研究的深入，中藥活性提取物在臨床中的應用逐漸廣泛。穿心蓮內酯為我國傳統中藥穿心蓮的主要有效成分，屬于二萜內酯類化合物，具有良好的抗炎活性，目前臨床上主要用于上呼吸道感染、細菌性痢疾的治療。尼莫地平為鈣離子拮抗劑類降壓藥，是臨床防治蛛網膜下腔出血等急性腦血管病的常用藥物。本實驗采用自體血注射法制備腦出血大鼠模型，模型大鼠呈現明顯的神經功能缺失、腦含水量升高，腦組織可見水腫、神經元數量減少、胞核固縮深染、炎性浸潤等病理學改變，與田青等[15]報道一致。進一步研究發現，經穿心蓮內酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠急性期神經功能缺失評分、腦含水量和腦血腫體積，明顯改善腦出血所致腦組織病理學改變，改善BBB通透性，并且穿心蓮內酯高劑量組效應優于尼莫地平組，提示穿心蓮內酯具有抑制腦出血大鼠急性期腦組織損傷的作用。

炎癥反應貫穿在出血性腦損傷的全過程，是導致繼發性腦損傷的重要原因。小膠質細胞、星型膠質細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等均參與腦出血后炎癥反應過程[16]。其中，小膠質細胞是特異性存在于腦組織中的免疫細胞，具有抗原傳遞、炎癥反應調節等生理學作用，腦出血發生后血腫占位和顱內高壓等將病理性刺激小膠質細胞活化，分泌細胞因子、炎性趨化因子而引發炎癥級聯反應[17]?；罨∧z質細胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6是引發機體炎癥反應的重要原因，并且IL-1β、TNF-α作為炎性趨化因子能夠進一步刺激粒細胞合成與釋放 IL-6 等炎性因子，從而形成炎癥級聯反應[18]。此外，腦出血后，星型膠質細胞能夠被病理性激活，進而釋放IL-6、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等炎性細胞因子[19]；中性粒細胞黏附于血腫周圍腦血管內皮細胞，快速浸潤進入腦組織并釋放炎性趨化因子[20]；T淋巴細胞是細胞免疫系統的重要組成部分，有研究發現，腦出血后T淋巴細胞CD4+、CD8+等能夠通過BBB進入腦組織而引發炎癥反應[21]。緊密連接復合體是BBB的基礎結構，陸正齊[22]和Dohgu等[23]研究發現，IL-1β、IL-6、TNF-α將破壞緊密連接復合體的結構并誘導內皮細胞黏附分子表達，從而導致BBB通透性升高。本研究發現，穿心蓮內酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠急性期腦組織和血清 IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并且穿心蓮內酯高劑量組的效應明顯優于尼莫地平組，提示穿心蓮內酯對腦出血后炎癥反應具有抑制作用，并說明穿心蓮內酯對腦出血后BBB損傷的保護作用可能與其抑制炎癥作用有關。

TLR是一類跨膜識別受體，其中TLR4廣泛存在于中樞神經系統小膠質細胞、星形膠質細胞、中性粒細胞及淋巴細胞中，在腦組織免疫應答及炎癥反應調節過程中發揮著重要的信號傳導作用[24]。本研究發現，腦出血大鼠腦組織TLR4蛋白表達水平明顯上調，該結果與張玉杰等[25]研究報道一致。NF-κB為TLR4下游靶基因，能夠被TLR4誘導表達與活化，活化NF-κB核轉位后能夠誘導IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子釋放，從而加重炎癥反應[26]。因此，TLR4/NF-κB信號通路在腦組織炎癥反應過程中具有重要調控作用。本研究結果顯示，穿心蓮內酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯下調腦出血大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平，并且穿心蓮內酯高劑量組對TLR4、NF-κB表達的調節作用優于尼莫地平組，提示穿心蓮內酯對腦出血后炎癥反應的抑制作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。

綜上所述，穿心蓮內酯能夠抑制腦出血大鼠急性期炎癥反應，減輕腦組織損傷，其機制可能與穿心蓮內酯抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關，本研究結果為穿心蓮內酯作為腦出血急性期治療備選藥物提供了支持。