NF-κB信號通路介導羥基紅花黃色素A減輕TNF-α誘導的內皮細胞EA.hy926損傷作用研究*

賀穩，陳晗，朱明明，楊學攀，余曦，施洪飛

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 泰州 215300

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)主要是由動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變引起，其發病率和死亡率逐年升高，成為人類健康的主要威脅[1]。血管內皮細胞激活是AS的顯著特征，也是AS最重要的始動因素[2]。美國Ross教授提出，AS是一種慢性炎癥性疾病[3]，內皮功能障礙會促進單核細胞、中性粒細胞等向血管壁黏附聚集，致使血管壁發生炎癥反應，進一步加重血管內皮損傷，從而促進AS的發生發展[4]。炎癥反應和氧化應激是AS進程中的兩個關鍵成分[5-6]，當受到炎癥介質如白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等刺激時，內皮細胞可表達一組復雜的基因，例如E-選擇素(E-selectin)、細胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)以及其受體等[7]，并參與到炎癥級聯反應中。核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)是機體抗炎和抗氧化的關鍵調控因子，在保護內皮細胞功能中發揮重要作用。相關研究表明，抑制NF-κB的激活可減輕炎癥反應和氧化應激，改善心肌功能[8]。因此，保護血管內皮細胞功能是一個有效的干預靶點，阻斷NF-κB激活可能是防治心血管疾病的關鍵策略。

中國傳統醫學認為IHD屬于“胸痹”“真心痛”等疾病范疇，其基本病機主要為“本虛標實”，即臟器虛衰，無力推動血液運行，造成“血瘀”實證。國醫大師張磊教授[9]認為治療胸痹心痛無論虛實，以祛邪通絡為先，活血通經藥物為基礎。杜武勛等[10]強調“血瘀”作為急性心肌梗死的基本病機，在治療中應以活血化瘀為主，標本兼治。紅花是活血通經、化瘀止痛的代表藥物，羥基紅花黃色素A(hydroxy safflor yellow A)是其關鍵活性成分。大量研究表明，羥基紅花黃色素A具有改善心肌缺血、抑制血栓形成、抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種藥理作用[11]。本課題組前期研究表明，羥基紅花黃色素A可以通過改善缺氧復氧損傷減輕內皮細胞凋亡[12]。為進一步研究羥基紅花黃色素A對心肌缺血損傷過程中的保護作用及其可能的機制，本實驗采用人重組TNF-α構建人臍靜脈內皮細胞EA.hy926損傷模型，探討羥基紅花黃色素A預處理對TNF-α誘導EA.hy926細胞損傷的保護作用及NF-κB信號通路在內皮細胞炎癥反應和氧化應激中的調節機制，為紅花對IHD的臨床治療提供科學依據。

1 材料

1.1 細胞人臍靜脈內皮細胞EA.hy926細胞株(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號：GNHu39)。

1.2 藥品和試劑羥基紅花黃色素A(質量分數≥98%，批號：H117996，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；TNF-α(美國Peprotech公司，批號：AF-300-01A)。胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-141)；不完全高糖培養基、蛋白提取試劑盒、細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物公司，批號：KGM12800-500、KGP2100、KGP150)；細胞毒性活性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，南京翼飛雪生物科技有限公司，批號：GK10001)；Hoechest染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：C1017)；一氧化氮(nitric oxide，NO)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：A012-1-2)；內皮素(endothelin-1，ET-1)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，貨號：m1025100)；逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：R223-01、Q321-02)；MCP-1抗體(北京Bioss公司，貨號：bs-23026R)；E-selectin、β-actin抗體(武漢Proteintech公司，貨號：20894-1-AP、81115-1-RR)；VCAM-1抗體(美國Abcam公司，批號：ab134047)；ICAM-1和p-IкB-α抗體(美國Affinity公司，貨號：AF6088、AF2002)；IкB-α、P65、P50抗體(美國Cell Signaling Technology 公司，貨號：4412、4764、13586)。

1.3 儀器3131型CO2培養箱、MICROCL 21R型冷凍離心機、CXX31型倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Multiskan spectrum 型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；1658000型電泳儀、1703940型半干轉膜儀、1708865型化學發光凝膠成像系統、1708265型實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Arium comfot1型純水超純水系統一體機(德國Sartorius公司)。

2 方法

2.1 細胞培養EA.hy926細胞培養在含10% FBS、80 U·mL-1青霉素及0.08 g·L-1鏈霉素的不完全高糖DMEM培養基中，并置于 37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中培養，每2天換液1次，待細胞長至80%左右時，用0.25%胰蛋白酶溶液進行消化、傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

2.2 CCK-8法檢測EA.hy926細胞活力

2.2.1 檢測不同濃度TNF-α刺激EA.hy926細胞后的細胞活力取對數生長期的細胞制成細胞懸液，顯微鏡下計數，接種于96孔板，每孔6.0×103個細胞，每組設置6個復孔。培養24 h細胞貼壁后加入不同濃度的TNF-α(0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1)干預24 h，吸出培養液，每孔加入含10%CCK-8溶液的培養液100 μL，置于 37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養2.5 h后，用酶標儀于450 nm波長測定每孔吸光度值(absorbance，A)，計算細胞存活率，以確定TNF-α的造模濃度。

細胞活力=A實驗組/A對照組×100%

2.2.2 檢測不同濃度羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞損傷模型細胞活力的影響取對數生長期的細胞制成細胞懸液，顯微鏡下計數，接種于96 孔板，每孔5.0×103個細胞，每組設置6個復孔，培養24 h細胞貼壁后加入不同濃度的羥基紅花黃色素A(0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1) 預處理24 h后，加入TNF-α(劑量為“2.2.1項”篩選出的最佳造模濃度)干預24 h，對照組細胞以 0.1% DMSO處理。檢測方法同2.2.1項，計算細胞存活率，以確定后續實驗羥基紅花黃色素A的干預濃度。

2.3 Hoechest染色檢測EA.hy926細胞凋亡情況將蓋玻片置于75%乙醇中浸泡3 min，取出晾干后用高溫滅菌好的1×PBS洗滌2遍，再用細胞培養液清洗1遍。清洗好的蓋玻片置于培養皿內并加入細胞混懸液，分為對照組、不同濃度TNF-α組及TNF-α(劑量為“2.2.1項”篩選出造模濃度)+不同濃度羥基紅花黃色素A組。對照組細胞以 0.1% DMSO處理。待培養結束后吸盡培養液，加入 0.5 mL 固定液，固定10 min后吸盡PBS，在培養皿內加入0.5 mL Hoechest33258染色液，5 min后吸盡染色液，PBS洗滌2次，每次3 min。將一滴抗熒光淬滅封片液滴在載玻片上，再將有細胞的蓋玻片蓋在載玻片上，充分接觸封片液，避免產生氣泡，并用指甲油固定蓋玻片邊緣，迅速置于熒光顯微鏡下(×200)進行觀察并拍片。

2.4 細胞上清液中NO、ET-1含量的檢測取對數生長期的細胞制成細胞懸液，顯微鏡下計數，接種于 24孔板中，每孔接種2.5×104個細胞，置于 37 ℃，5% CO2培養箱中培養。細胞分為4組，分別為對照組、TNF-α組、1 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組和10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組，每組設置3個復孔。細胞貼壁后，加入相應濃度的羥基紅花黃色素A預處理24 h后加TNF-α(劑量為“2.2.1項”篩選出造模濃度)干預24 h，對照組細胞以 0.1% DMSO處理。收集上清液，硝酸還原酶法檢測NO 含量，ELISA 法檢測 ET-1含量，所有操作均按試劑盒說明書進行。

2.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1以及NF-кB信號通路相關蛋白的表達水平取對數生長期細胞制成細胞懸液，接種于培養皿中，細胞分為3組，對照組、TNF-α組和10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組。細胞貼壁后，加羥基紅花黃色素A預處理24 h后加TNF-α(劑量為“2.2.1項”篩選出造模濃度)干預24 h。培養結束后將細胞取出，PBS清洗2次，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取 EA.hy926 細胞總蛋白，細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒制備細胞質蛋白和細胞核蛋白。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度，對每個樣本進行三次評估，取三次的平均值。將計算好的蛋白樣本與5×上樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min，-20 ℃保存備用。上樣，120 V、20 min電泳至上層膠分開后200 V、35 min 電泳至結束。10 V、1 h轉至PVDF膜，脫脂牛奶封閉 1 h。一抗(稀釋比例11 000)4 ℃搖床，最小轉速孵育過夜。回收一抗，1×TBST 洗膜3次，每次10 min。二抗(稀釋比例110 000)室溫低速搖床孵育1 h，棄去二抗，1×TBST洗膜3次，每次 10 min，之后繼續1×TBST洗膜4次，每次10 min。按照說明書配制好發光液(11)，用化學發光成像儀曝光，盡量保持在避光的狀態下操作，將成像的條帶保存，并使用Image J對條帶進行灰度分析。

2.6 RT-qPCR檢測SOD、CAT、GSH-pxmRNA的表達取對數生長期的細胞制成細胞懸液，接種于培養皿中，分組同“2.5”項。培養結束后將細胞取出，吸盡培養液，加入1 mL Trizol提取RNA，蛋白核酸測定儀檢測RNA濃度。使用逆轉錄試劑盒將RNA轉錄成cDNA。按Real-timePCR試劑盒說明書配制反應體系：10 μL 2×Cham QSYBR qPCR Master Mix、0.4 μL Primer1 (10 μmol·L-1)、0.4 μL Primer2(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA，加入DEPC水至 20 μL，每組3個復孔。反應程序為 95 ℃、5 min預變性；95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s擴增，40個循環；70 ℃、5 s，95 ℃、5 s溶解。采用2-ΔΔCt法進行數據分析。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司提供，序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 TNF-α對EA.hy926細胞活力及凋亡的影響實時生長圖片監測顯示，與0 μg·L-1TNF-α組比較，20 μg·L-1TNF-α組、50 μg·L-1TNF-α組細胞密度明顯下降，見圖1A；CCK-8實驗結果顯示，與0 μg·L-1TNF-α組比較，隨著TNF-α濃度增加，其對EA.hy926細胞活力的抑制作用顯著增強(P<0.01或P<0.001)，見圖1B。Hoechest染色結果顯示，20 μg·L-1TNF-α組、50 μg·L-1TNF-α組細胞核體積明顯縮小、破碎，且呈深染核形態，說明TNF-α能夠誘導內皮細胞凋亡，見圖1C。因此，后續實驗選擇20 μg·L-1TNF-α為造模條件。

注：A：細胞生長情況比較；B：細胞活力比較；C：細胞凋亡情況比較；與0 μg·L-1 TNF-α比較，**P<0.01，***P<0.001；圖中標尺長度代表100 μm；n=6

3.2 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞損傷模型細胞活力及凋亡的影響CCK-8實驗結果顯示：與對照組比較，TNF-α能夠明顯抑制EA.hy926細胞活力(P<0.001)；與 TNF-α組比較；羥基紅花黃色素A (1～10 μmol·L-1)預處理可明顯改善TNF-α刺激后EA.hy926細胞活力，其中以10 μmol·L-1作用尤為顯著(P<0.001)，但羥基紅花黃色素A的濃度為100 μmol·L-1時對細胞的活力反而具有抑制作用。Hoechest染色結果顯示：與對照組比較，TNF-α組細胞核體積明顯縮小、破碎，呈深染核形態；與 TNF-α 組比較，羥基紅花黃色素A(1～10 μmol·L-1)預處理組顯示細胞核深染形態減少，10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組效果更為明顯。因此，后續實驗選擇1 μmol·L-1、10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A作為實驗細胞預處理濃度。見圖2。

3.3 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞損傷模型細胞上清液中NO及ET-1含量的影響與對照組比較，TNF-α組細胞釋放的NO含量顯著減少(P<0.001)，而ET-1含量顯著增多(P<0.001)；與TNF-α組比較，10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A預處理能顯著增加細胞NO的釋放并降低ET-1的水平(P<0.01)，見表2。實驗結果表明，羥基紅花黃色素A可以通過調節NO/ET-1 平衡來改善TNF-α誘導的EA.hy926細胞內皮細胞功能障礙。在此基礎上選擇10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A作為后續實驗細胞預處理的最佳濃度。

表2 各組NO、ET-1水平比較

3.4 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞中E-selectin、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達水平的影響血管內皮產生損傷時，局部會發生炎癥反應，炎癥區域可產生和釋放相關炎癥因子，本研究用TNF-α刺激血管內皮細胞24 h，Western Blot檢測結果顯示，與對照組比較，TNF-α組細胞中E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01或P<0.001)；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：A：E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白條帶圖；B：E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白量化結果比較；n=3；與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞氧化應激的影響RT-qPCR檢測結果顯示，與對照組比較，TNF-α組細胞中SOD、CAT、GSH-pxmRNA表達水平顯著降低(P<0.01或P<0.001)；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組SOD、CAT、GSH-pxmRNA表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。由此證明，炎癥介質 TNF-α 可以誘導細胞發生過氧化損傷，而羥基紅花黃色素A預處理對TNF-α誘導的EA.hy926細胞氧化應激具有抑制作用。見圖4。

注：A：SOD mRNA結果比較；B：CAT mRNA結果比較；C：GSH-px mRNA結果比較；n=3；與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.6 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的EA.hy926細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的影響為進一步確定羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的 EA.hy926細胞氧化應激和炎癥反應作用的潛在機制，本研究分析了NF-κB通路相關蛋白表達水平的變化。Western Blot檢測結果顯示，與對照組比較，TNF-α組p-IκB-α及細胞核中P65、P50蛋白表達水平顯著升高(P<0.01或P<0.001)，IκB-α 及細胞漿中P65、P50蛋白表達水平顯著降低(P<0.01或P<0.001)，提示TNF-α可促進 IκB-α 的磷酸化及P65/P50轉位入核；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組p-IκB-α及細胞核中P65、P50蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，IκB-α 及細胞漿中P65、P50蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，說明羥基紅花黃色素A可抑制 TNF-α 誘導的IκB-α的磷酸化及P65/P50轉位入核。這些結果提示羥基紅花黃色素A可抑制TNF-α誘導的內皮細胞中NF-κB活性，從而發揮抗炎和抗氧化作用。見圖5。

注：A：IκB-α及p-IκB-α蛋白表達條帶圖及量化結果比較；B：細胞漿中P65、P50蛋白表達條帶圖及量化結果比較；C：細胞核中P65、P50蛋白表達條帶圖及量化結果比較；n=3；與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與 TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

近幾十年來，伴隨人口老齡化的增長和人們生活方式的多樣化，缺血性心臟病已然上升為威脅國民生命健康的主要原因[13]。AS是多種心腦血管疾病的共同病理基礎，也是缺血性心臟病最常見病因，因此，加強防治AS刻不容緩。研究發現，AS進程中氧化應激損傷和炎癥反應損傷機制與中醫學血瘀證理論密切相關[14-15]。炎性因子和氧化因子在動脈粥樣硬化進程中發揮重要作用，最終導致缺血性心肌損傷[2，6，16]。在此認識的指導下，深入研究活血化瘀中藥在AS進程中抵抗內皮細胞炎癥反應和氧化應激的作用及其可能機制有助于為臨床上應用活血化瘀中藥防治缺血性心臟病提供科學依據。

研究證明，NO和ET-1是一對作用相反的血管活性分子，是反映血管內皮功能的代表性指標[17]。調節NO /ET-1動態平衡有利于維持血管內皮功能正常，從起始環節干預AS的形成，有效防治AS導致的心腦血管疾病[18-19]。本研究結果顯示，羥基紅花黃色素A預處理可以促進NO的釋放，抑制ET-1水平的升高，從而改善TNF-α誘導的EA.hy926內皮細胞功能障礙。

血管炎癥是AS的關鍵病理生理反應[20]，及時的抗炎措施有利于減緩AS的進程。E-selectin主要表達于活化的內皮細胞中，在AS的早期階段極大影響了白細胞與內皮細胞的相互作用[21]。MCP-1 能夠介導白細胞聚集到損傷部位，與損傷的組織細胞黏附，引起組織二次損傷[22]。ICAM-1和 VCAM-1 參與白細胞的黏附和轉運，在響應炎癥細胞因子刺激時被上調[23-24]。氧化應激同樣在AS中發揮重要作用，其中SOD、CAT和GSH-px是評價機體氧化應激水平的良好指標，SOD是機體內清除氧自由基的重要抗氧化酶，能保護細胞免受氧化損傷[25]；CAT是一類氧化還原酶，可以催化過氧化氫分解無毒的分子氧和水，減少細胞氧化損傷；GSH-px 對催化還原型谷胱甘肽具有特異性，能夠保護細胞膜結構及其功能[26-27]。研究表明，羥基紅花黃色素A可保護內皮細胞免受炎癥損傷[28]，但其對TNF-α誘導的內皮細胞炎性反應及氧化應激損傷的影響國內外研究較少，具體機制也未闡明。因此，本課題組利用TNF-α刺激EA.hy926內皮細胞模擬細胞損傷環境，進一步詳細地研究羥基紅花黃色素A的抗炎與抗氧化活性及其作用機制。結果顯示，羥基紅花黃色素A能夠保護內皮細胞活力，減少細胞凋亡，降低炎癥因子E-selectin、ICAM-1、VCAM-1以及趨化因子MCP-1的蛋白表達水平，同時上調SOD、CAT、GSH-px的mRNA表達量，說明羥基紅花黃色素A能夠減輕TNF-α誘導的炎癥損傷和過氧化損傷，提高機體抗炎和抗氧化能力。

核轉錄因子-κB存在于體內多種細胞中，是介導細胞炎癥反應的網絡中心[29]。研究表明，抑制NF-κB可調節心肌損傷后TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的表達，顯著抑制心肌炎癥反應，從而減少心肌損傷[30]。報道顯示，NF-κB是活性氧誘導動脈粥樣炎癥反應的介導劑，并參與到炎癥級聯反應中[31]。由于IκB-α與NF-κB P65/P50會形成細胞質復合物，以防止其核移位，因此，抑制 NF-κB 信號通路激活的關鍵步驟之一是抑制IκB-α的磷酸化和降解。本實驗的研究結果顯示，羥基紅花黃色素A預處理的細胞在蛋白水平上表現出減少IκB-α的磷酸化和降解，從而阻止P65/P50向核移位。

綜上所述，TNF-α可誘導EA.hy926細胞炎癥反應和氧化應激損傷，而活血化瘀中藥紅花的關鍵活性成分羥基紅花黃色素A能夠增加 NO含量，抑制ET-1表達，改善內皮功能障礙，減少E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表達，增強SOD、CAT、GSH-px的表達，從而發揮抗炎和抗氧化作用，且其抗炎活性及抗氧化能力可能與 NF-κB 信號通路的調控有關。本研究可能為中醫藥干預心肌缺血性心血管疾病提供新的見解，有助于未來心血管疾病的防治。