液相色譜法對動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定

招鈺娟 何國成 林慶昶 周秀瑩 賈曉菲 林小貞 黎小鵬

(中山市農產品質量安全檢驗所，廣東 中山 528437)

磺胺類藥物(sulphonamides,SAs)是人工合成的抗菌藥，早在1935年開始用于臨床，與其他抗菌藥相比其應用的時間較長，具有性質穩定、使用簡便、抗菌譜廣等特點，至今在養殖生產和臨床中仍廣泛使用，是重要的化學治療藥物。我國的養殖生產還處于散戶養殖較多的階段，部分養殖戶由于對抗菌藥缺乏了解而未合理使用或過度使用，引起細菌對于磺胺類藥物的耐藥性，藥物殘留從而污染下游產品，進而危害人體健康。近年的研究表明，長期對動物使用SAs，特別是磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉等，殘留物有可能引起人體過敏、中毒、造血功能障礙、急性溶血性貧血、粒細胞缺乏癥等，也有致畸、致癌、致突變的“三致”作用，并可能導致耐藥性菌株產生，造成生態環境污染[1]。因此，為了保障動物用藥的安全性和有效性，國際食品法典委員會(CAC)以及許多的國家都對動物源性食品中的SAs含量都作了非常嚴格的規定[2]，我國在《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》GB 31650-2019中明確要求，所有動物產品中SAs的最高殘留限量為0.1mg·kg-1，同時磺胺二甲基嘧啶在牛奶中的殘留限量為0.025mg·kg-1。

SAs是以對氨基苯磺酰胺結構為主體的藥物總稱，一般為白色或微黃色結晶性粉末，遇光易變質，顏色逐漸變深，有共同的對-氨基苯磺酰胺母核結構，大多數SAs具有酸堿兩性，可溶于酸或堿溶液中，也較易溶于乙醇、乙腈或丙酮中；大多數SAs在水中溶解度極低[3]。根據SAs的理化特點，研究人員開發了多種檢測方法，主要有熒光光譜法[4]、化學發光法[5]、表面增強拉曼光譜法[6]、電化學法[7]、免疫分析法[8]、微生物抑制法[9]、毛細管電泳法[10]、高效液相色譜法[11]、液相色譜-串聯質譜法[12,13]。我國有關部門已發布多個磺胺類藥物殘留量的檢測標準，主要使用液相色譜法和液質聯用技術。液質聯用是目前SAs定性定量檢測靈敏度高、準確性好的方法，但由于儀器昂貴，對使用人員要求高，在基層實驗室尚未普及。而液相色譜-紫外檢測器，是多數實驗室配置的儀器，絕大部分基層實驗室已配置，具有選擇性高，定量準確、穩定，靈敏度適用等優點。針對我國畜禽養殖目前還處于散戶養殖階段的特點，基層實驗室使用液相色譜法開展SAs殘留量檢測，及時發現養殖生產中濫用抗菌素的問題，可預防超標產品進入市場危害人們健康。目前現行有效的SAs液相色譜檢測標準，多發布于十多年前，前處理操作比較復雜，隨著檢測技術理論的發展，并針對各自實驗室的儀器、人員配置等實際情況開展研究，選擇出結果穩定、操作簡易的前處理和儀器方法，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-紫外檢測器HPLC1260-VWD(安捷倫科技有限公司)；振蕩搖床KS-501(德國IKA集團)；渦漩振蕩器(德國IKA公司)；離心機Sigma 3-30KS(德國Sigma離心機有限公司)。

5種磺胺標準品，磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉，購自德國DrEhrenstorferGmbH公司。

乙腈、甲酸(色譜純,Fisher公司)；無水硫酸鈉(分析純，廣州化學試劑廠)；堿性氧化鋁固相萃取柱(6mL，2g SUPELCO)、0.2μm PTFE針式過濾器(安捷倫科技有限公司)；實驗室用水為Milli-Q超純水。

洗脫液：25mL乙腈加0.3mL甲酸加75mL水混合，搖勻。

1.2 提取

取畜禽肌肉、肝臟樣品，攪拌成勻漿狀。稱取5.00g(±0.05g)試樣于50mL離心管中，加入約5mL水、2顆陶瓷均質子、20.00mL甲酸乙腈(甲酸0.3%)，搖床震蕩30min，300rpm。加入8～10g無水硫酸鈉，渦旋震蕩1min，8000rpm離心5min，全部上清液轉至另一50mL離心管，加入約15mL正己烷，渦旋震蕩1min，棄去上層，再加入約15mL正己烷，渦旋震蕩1min，8000rpm離心5min，下層(乙腈層)備用。

1.3 凈化

準確吸取上述備用液(下層)16.00mL注入已活化的堿性氧化鋁固相萃取柱，上樣前用10mL乙腈活化，在自然重力下流出，棄去濾液，擠干，2mL洗脫液洗脫，重復1次，收集全部洗脫液，定容至總體積4mL，過0.2μm PTFE針式過濾器后上機檢測。

1.4 標準溶液配制

分別準確稱取5種磺胺類藥物10mg (精確至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10mL,配制成1mg·mL-1的標準儲備液。

分別準確移取上述單一標準溶液0.10mL于同一10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到10μg·mL-1的混合標準儲備液，于-18℃以下保存。

準確吸取混合標準儲備液0.10mL于樣品瓶中，加入0.90mL洗脫液，得到1000μg·L-1的混合標準溶液；精確吸取一定量的混合標準溶液，用洗脫液稀釋成質量濃度為20μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1、1000μg·L-1的標準工作溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱，Agilent Pursuit 5 C18(150mm×4.6mm，5.0μm)，柱溫為35℃；檢測波長270nm；進樣量20.0μL，流量1.000mL·min-1，流動相洗脫程序如表1所示，后運行時間1min。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

乙腈[14]和乙酸乙酯[15]是SAs常用的提取溶劑，而SAs容易在酸性溶液中離子化[16]，提高提取效率。同時考慮到畜禽產品含有較高的蛋白質，容易對檢測造成干擾，含有乙腈的提取溶劑具有沉淀蛋白、減少共提物的作用[17]，結果則為色譜圖的雜峰較少。本研究比較了乙腈、甲酸乙腈和乙酸乙酯3種提取溶劑，考察添加濃度0.040mg·kg-1的回收率和相對標準偏差值，觀察加標樣品的色譜圖，比較不同提取溶劑對后續凈化步驟操作便利性的影響等多種因素，優選出甲酸乙腈作為本試驗的提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇

本試驗使用液相色譜-紫外檢測器，檢測波長270nm，與液質聯用法相比選擇性較弱，只是以保留時間作為定性條件，凈化效果低的方法容易產生干擾。比較QuEChERS[18]凈化管(內含50mg PSA、150mg C18EC 和900mg Na2SO4，15mL)、陽離子交換(MCX)固相萃取柱[19]、堿性氧化鋁固相萃取柱[14,20]3種凈化方法，3種方法的加標回收率均在70%～110%，但QuEChERS凈化管的色譜圖有比較多雜峰，容易產生干擾；MCX柱容易發生堵塞現象[21]，選擇堿性氧化鋁SPE柱作為本研究的凈化方法。使用甲酸乙腈作提取溶劑，結合堿性氧化鋁柱凈化，經優化后整個前處理不需要使用旋轉蒸發儀、氮吹儀濃縮或置換有機溶劑，大大減少前處理時間，簡化操作，也能減少SAs的揮發，提高提取凈化效率，提高結果的準確性。與趙敏兒[22]的實驗結論一致。

2.3 方法學考察

2.3.1 定量方法的線性檢測范圍

以混合標準溶液的濃度為橫坐標，各目標化合物色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，其線性關系相關系數、回歸方程見表2。5種磺胺在0.02～1000mg·L-1范圍內線性關系良好，r2值均大于0.9999。

2.3.2 方法檢出限

方法檢出限按低濃度點0.05mg·kg-1的響應值與基線噪聲響應的3倍計算，檢出限結果見表2。5種磺胺的方法檢出限為0.003～0.005mg·kg-1，能滿足動物源性食物中磺胺類抗生素的檢測。5種磺胺類藥物標準溶液色譜圖見圖1。

表2 動物源性食物中5種磺胺的回歸方程、相關系數、檢出限

2.3.3 方法回收率和精密度

在相同的試驗條件下，分別對6個空白雞肉、豬肝、脂肪樣品添加濃度為0.020mg·kg-1、0.040mg·kg-1、0.200mg·kg-1的5種磺胺混合標樣，進行加標回收和精密度測試，同時進行空白試驗，測試結果見表3。5種磺胺的加標回收率為80.1%～108%，相對標準偏差2.48%～10.0%。方法具有很好的回收率和精密度。

圖1 5種磺胺類藥物標準溶液色譜圖(0.05μg·mL-1)

表3 動物源性食物中5種磺胺的加標濃度、加標回收率和相對標準偏差

3 結論

本研究通過優化提取溶劑，有效提高提取效率，簡化提取步驟；使用正己烷前處理，并優選出固相萃取小柱同時富集和凈化，簡化整個前處理的步驟，無需旋轉蒸發儀濃縮、氮吹儀置換溶劑，大大提高工作效率，前處理操作比較簡便。結合高效液相色譜和紫外檢測器，建立了操作簡便、回收率高、準確穩定的動物性食品中5種常用磺胺類藥物殘留的分析方法,易于在基層實驗室開展測定，及時發現養殖生產中的磺胺類藥物濫用情況，為農業行政主管部門制定政策和加強管理提供參考。