大花卷丹繁殖方法及脫毒技術的研究

于新海 李濛 周紅昕

(吉林省生物研究所，吉林 長春 130000)

百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)又名番韭、山丹、倒仙等，是百合科百合屬(Lilium)多年生草本球根類植物，目前全球共發現120個種，我國有55個種，36個特有種。長白山區的百合種源數較少，有9個種，2個變種[1]。由于特殊的地理位置和氣候條件，長白山區的野生百合無論從株型花色、生長條件和營養成分含量上都具有不可替代的作用。百合屬藥食同源植物，在潤肺止咳、清心安神，補中益氣等方面有著顯著功效[2]，尤其是大花卷丹，近年來在吉林省廣泛種植，成為吉林省部分地區帶動農戶致富的經濟作物，對吉林省特色經濟提升具有十分重要的推動意義。

吉林省長白山區野生百合的開發和利用處于起步期，對長白山區野生百合的引種種植沒有形成規模化，在食用百合種植方面，全省種植面積在50hm2左右，分布在蛟河、靖宇、伊通和通化。散戶種植數量幾乎沒有，多以小規模個體農場、小型農業公司在種植。其原因歸結于2方面，對長白山區野生百合品種的應用方向了解不夠，不能準確定位長白山野生百合品種的市場前景和應用方向；長白山區野生百合的數量有限，人工栽培需要大量種球或種苗，因未解決種球繁殖培育技術，限制了長白山區野生百合的種植推廣。

同時，由于森林銳減、濕地開墾、隨意采挖、鐵路公路建設、開礦及周邊環境污染、放牧及野生動物啃食鱗莖、人工造林(包括外來樹種、物種引入)等，有些長白山野生百合品種已經成為瀕危品種，如垂花百合已被列入國家二級保護品種(第2批)。所以，僅依靠野生百合種源已經無法支撐吉林省百合種植產業的需求[3]。

因此，對大花卷丹繁殖技術的研究，不僅可以為企業提供成熟優質、無毒種球的培育方法，避免在種植過程中面臨無種可種的“卡脖子”問題在吉林省發生，還可以有效推動吉林省百合產業的大發展和野生百合資源保護、開發及利用。

1 大花卷丹的傳統繁殖方法

大花卷丹的傳統繁殖方式主要有無性繁殖和有性繁殖2種，主要以種球移栽、鱗片扦插以及種子播種等方式進行培育[4]。

1.1 有性繁殖

為了增加大花卷丹的產量，在種植過程中通常采取去花處理，但為了保證大花卷丹的優良性狀和種植的觀賞性，在提純復壯過程中會留一部分進行留花留種，這樣在花期后形成的蒴果中可以得到大量種子，在北方的9月10—20日種子成熟后便可以采收。

采收后的蒴果去殼后晾干儲存，千粒重約3.7g。入冬后，將采收后的種子用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，再入清水浸泡20min，與3倍體積清洗后的細河沙混勻后分包入冷庫沙藏，儲藏條件為溫度-5～-1℃，濕度為70%～80%。第2年5月進行旋耕整地做畦，標準為畦面寬120cm，作業道60cm，在畦面上進行播種，均勻播撒約500粒·m-2種子，覆蓋細土3～5cm，用薄草簾覆蓋并噴水保濕。10～15d便可出苗，出苗后去除草簾，進行田間管理，2a后便可進行種球收獲移栽[5]。

1.2 無性繁殖

1.2.1 鱗片的扦插

北方地區，大花卷丹在9月10—20日地上部分已經返黃干枯，這時對大花卷丹進行采收，采收后的商品鱗莖通常會進行去除外層鱗片，抽真空塑封后進行銷售。在去除的外層鱗片中，篩選出無病斑、無腐爛的正常鱗片作為扦插鱗片。不僅充分利用剝離的外層鱗片，避免浪費，而且有利于扦插鱗片的出苗和生根后的幼苗生長。

將篩選出的外圍鱗片用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，入清水浸泡5min，取出后晾干表面水分備用。另選扦插用地，避免重茬，進行旋耕整地做畦，標準為畦面寬120cm，作業道60cm，在畦面做行距10cm、深5cm的壟溝，將準備好的鱗片，基部沾取溶解后的生根粉溶劑，凹面向上斜插入壟溝內，覆蓋細土后，用薄草簾覆蓋保濕，此時秋季溫度在20℃左右，鱗片在土壤中萌發，生根，但不會出苗，進入冬季后休眠，第2年春季出苗后去除草簾，進行田間管理。秋季進行收獲種球分級移栽[6]。

1.2.2 種球分級移栽

近幾年，大花卷丹在東北地區的種植面積不斷擴大，根據大花卷丹的生長特性，每株大花卷丹地下根莖橫走并生長出多個鱗莖，通過對繁殖的小鱗莖即種球的分級移栽，可有效控制移栽的種植密度，避免大小種球混栽出現株距不足、長勢不一致而導致管理不便、養分不足、土地浪費等現象[7]。通過對種球品質的篩選，有利于種植過程中病害的防治及種源的提純復壯[8]。

秋季對大花卷丹進行收獲時，根據鱗莖的大小將收獲的種球分為商品球、一級種球(20～30g)、二級種球(15～20g)和三級種球(15g以下)。分級后的種球，用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，晾干表面水分。另選種植用地，避免重茬，進行旋耕整地做畦，標準為畦面寬120cm，作業道60cm，一級種球株行距15cm×15cm，二級種球株行距10cm×10cm，三級種球選擇播撒的方式，以250kg·667m-2的標準均勻播撒在畦面上，覆蓋細土7～10cm即可。定植后用玉米秸稈碎屑或者松針覆蓋，澆透水，第2年出苗后進行田間管理[9]。

2 大花卷丹的組織培養及脫毒

在百合種植過程中，由于多年輪作，對種源質量把控不嚴，出現種源嚴重退化現象，現已檢測出吉林省百合多攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)，對百合的產量造成了嚴重的損失，成為限制吉林省百合大規模種植的關鍵因素之一。百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)與百合無癥病毒(LSV)是最易感染百合、危害最大的3種病毒[10]。其中，黃瓜花葉病毒會造成葉萎縮黃化、變皺、莖變形等病癥[11]。然而，上述3種病毒常伴隨出現，導致百合花葉斑駁、花葉變形、植株矮化或無主桿、百合切花或鱗莖品質不合格[12]，在種植生產上，百合的繁殖方式主要靠無性繁殖技術——扦插、分球等，這種方式會使感染百合的病毒不斷傳代，在開放環境下擴散感染其他植株，擴大病毒傳播范圍，對百合種植業造成嚴重的經濟損失[13]。因此，百合脫毒苗制備技術對切斷病毒傳播、減少經濟損失至關重要。

2.1 大花卷丹的組織培養

大花卷丹經過多代的種植常伴有種源退化和病毒積累等現象，所以目前通過組織培養技術對大花卷丹進行快速繁殖，既可以滿足吉林省在大花卷丹種植生產上對種源的迫切需要，又能在組織培養的基礎上對侵染病毒的植株進行脫毒[14]。成海鐘等研究發現，在培養基中添加0.1mg·L-16-BA或KT可顯著提高百合繼代培養中芽的增殖效果，6-BA的效果優于KT的效果[15]；石印等研究發現，大花卷丹組織培養啟動階段添加6-BA和NAA可獲得較好的不定芽誘導率，其中，細胞分裂素6-BA對大花卷丹的促進效果較明顯[16]。

2.1.1 外植體誘導

通過實驗得知，大花卷丹的不定芽誘導率、增殖倍數與所取鱗莖部位有密切關系。最佳取材部位為大花卷丹的中層鱗片，用洗衣粉水將鱗片沖洗干凈后，流水沖洗60min，將外植體置于超凈工作臺中，75%酒精消毒90s，去離子水漂洗3遍，0.1%升汞處理30min，去離子水漂洗3遍，無菌濾紙吸干表面水分，將鱗片縱向切成長條鱗片(寬0.5～0.7cm)作為外植體接種于MS加NAA 0.1mg·L-1加6-BA 2mg·L-1誘導培養基上，每瓶接種3～4塊切好的鱗片，在培養間內觀察并及時去除染菌培養瓶。培養間條件：溫度23～25℃，光照13～15h·d-1,光強為1500～2000lx。培養周期為25d，此時誘導率達75.7%。

2.1.2 不定芽增殖培養

誘導后的叢生芽長度在2cm以上時，分切轉入增殖培養基內培養，增殖培養基：MS加NAA 0.2mg·L-1加6-BA 3mg·L-1加GA31mg·L-1，培養周期為22～25d，此時增殖系數達3.56。

2.1.3 小鱗莖誘導培養

經過增殖培養后將叢生芽分成單株，轉入小鱗莖誘導培養基內培養。小鱗莖培養基：MS加NAA 1.0mg·L-1。23d左右膨大，形成小鱗莖后進行生根培養，此時也有部分鱗莖有生根現象。

2.1.4 小鱗莖生根培養

經過小鱗莖誘導后，小鱗莖開始膨大，將較大肥厚籽球至少有5個鱗片的小鱗莖轉入生根培養基中培養。生根培養基：MS加IAA 0.2mg·L-1。培養10d后小鱗莖開始生根，在20d后基本完成生根，此時生根率可以達97.3%，平均每顆小鱗莖生根數可達9.2條。

2.1.5 組培苗出瓶移栽

根據莖葉及根的生長狀況可以進行煉苗出瓶。選擇根長在1cm以上，莖葉多的組培瓶進行開瓶煉苗，移栽至含有基質的穴盤內。扣棚保溫保濕，在8d左右開始萌發新葉，出瓶苗成活率達96.7%。

2.2 大花卷丹的脫毒

近年來，百合常用的脫毒方法有莖尖培養、珠芽培養、熱處理、化學藥劑處理等，通常根據百合植株所攜帶病毒的種類采用不同的方法或者多種方法相結合對帶病植株進行脫毒和二次脫毒，達到獲得無毒種苗的目的[17]。本次脫毒實驗是以吉林省目前已檢測出攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)的大花卷丹鱗莖為試材，采取熱處理和莖尖培養相結合的方法進行脫毒，運用RT-PCR方法檢測病毒，獲得無毒植株并進行擴繁。

通過組培的方法獲得攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)的大花卷丹生根組培苗，將組培苗放入光照培養箱內培養，溫度設置為40℃，其它培養條件與培養室條件相同。進行熱處理3d后，在超凈工作臺內利用解剖鏡剝取0.5mm左右莖尖并接種在MS加NAA 1.0mg·L-1培養基上培養。擴繁培養單個莖尖所產生的組培苗并做好分類標記，運用RT-PCR方法對各組組培苗檢測黃瓜花葉病毒(CMV)，淘汰帶毒組，將成功脫毒的大花卷丹進行組培擴繁，獲得無毒植株。

3 小結與討論

近年來，吉林省百合產業正蓬勃發展，無論是觀賞、食用還是藥用百合種植面積正在逐年擴大，尤其是大花卷丹，企業與種植戶為了最快獲取經濟效益，只采用移栽種球的方法進行種植，目前在種植方面已出現大面積黃苗、減產、種源退化現象。為了避免大花卷丹在種植過程中出現種源不足或無種可種的情況在吉林省發生，通過探究大花卷丹的多種繁殖方式，合理規劃種植區域，做好大花卷丹優質種源的培育工作，是企業和種植戶持續獲益的前提，是吉林省百合產業大發展的基礎保障。