一株草原野生花臉香蘑菌種培養基的篩選研究

隋業璇 徐偉良 李春冬 郭梁

(錫林郭勒職業學院生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000)

花臉香蘑(Lepista sordida)屬于擔子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、香蘑屬，又因其菌肉呈淡紫羅蘭色，又名紫晶香蘑、丁香蘑、花臉蘑等[1]。花臉香蘑廣泛分布于內蒙古、東北、甘肅、河南、四川等地，多產于夏秋季節，群生或簇生于草原、山坡、林中草地，是一種開發潛力巨大的優質藥食同源菌種[2,3]。紫花臉香蘑所含多糖成分可間接調節益生菌和有害菌二者的競爭關系、促進骨骼生長、降低血糖等[4]。花臉香蘑含各種氨基酸，胡先運等通過用土豆、酵母膏、蔗糖和生長因子制成的液體培養基培養后測得，花臉香蘑菌絲體富含8種人體必需氨基酸，且總氨基酸含量達51.49%，高于一些常見的真菌，如靈芝等[5]。花臉香蘑中鈣、鐵、胡蘿卜素和煙酸含量豐富，還含有較多的微量元素，具有養血、益神和補五臟的功效，常食有利于治療貧血、久病體虛、神疲和健忘等癥，并具有抑制癌細胞的功效和廣泛的抗菌活性[6,7]。宋曉琳等通過建立小鼠急性化學性肝損傷模型研究發現，花臉香蘑多糖具有一定的抗氧化作用，對氯仿(CCl4)誘發的小鼠急性肝損傷具有保護作用[8]。陳湘蓮等用二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)法對從花臉香蘑分離提取的發酵次生代謝物質研究表明，菌絲提取物具有較強的抗氧化、抗腫瘤活性[9]。

目前，對于花臉香蘑的研究主要集中在生物學特性、液體發酵培養及生物活性成分，對栽培馴化的研究報道較少。羅倩等以菌絲生物量為主要指標，對1株分離的花臉香蘑HL-07菌株進行液體培養基優化，篩選出了適宜其菌絲生長的液體培養基[10]。許瀛引采用液體發酵技術獲取足量的花臉香蘑菌絲體[11]。張俊波等利用谷殼、干牛糞、菜籽餅、麥麩、碳酸鈣和石灰石膏制成合適出菇的栽培種[12]。孟玲等通過對碳源、氮源、碳氮比、無機鹽等營養因子進行分析研究，優化了花臉香蘑菌絲體固體培養所需等生長因素配比[13]。賀永國等利用用浸泡后的麥粒、發酵好的白參菌菌糠進行實驗室栽培種出菇[14]。綜上所述，花臉香蘑的菌種培養基的篩選、培育與人工馴化栽培還處于實驗室研究階段，未見大規模商業化栽培。

花臉香蘑在內蒙古草原地區均勻分布，其中在錫林郭勒和呼倫貝爾草原野生菌群資源豐富，產量較多。但由于花臉香蘑缺乏科學研究及保護，人工馴化栽培技術尚未獲得實質性的突破。隨著生態環境的不斷變化，其生境破壞嚴重，并由于每年生長時間短，自然采集量低，有價無貨，導致野生花臉香蘑菌群分布逐漸減少，亟需對野生花臉香蘑種質資源開展研究和保護。本研究對采集于錫林郭勒草原的野生花臉香蘑子實體進行分離培養，選取常用的固體培養基、液體培養基及栽培種培養基進行人工馴化培養研究，篩選出適合花臉香蘑菌絲生長的固體培養基、液體培養基以及栽培種培養基為后續花臉香蘑的人工馴化和仿野生栽培種提供優質種質。

1 材料與方法

1.1 材料

野生花臉香蘑子實體采集于內蒙古錫林郭勒盟草原，分離鑒定菌絲體由錫林郭勒職業學院生物工程研究院提供。

1.2 培養基

1.2.1 固體培養基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然[15]；PDA加富培養基，g·L-1：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g，pH自然[16]；改良PDA培養基，g·L-1：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，維生素B10.01g，瓊脂20g，pH自然[17]。

1.2.2 液體培養基配方

液體培養基1，g·L-1：馬鈴薯切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO41.5g，pH自然[18]；液體培養基2，g·L-1：玉米粉30g，蔗糖10g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH自然[19]；液體培養基3，g·L-1：蔗糖30g，酵母膏6g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O 1g，pH自然[20]。

1.2.3 栽培種培養基配方[21]

高粱1.0kg，麩皮50g，石膏50g，木屑200g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，蒸餾水根據濕度添加。

1.3 設備

SW-CJ-2D超凈工作臺，上海昕儀儀器儀表有限公司；HWS-250BX恒溫恒濕培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；202-3A電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電子萬用爐，北京市永光明醫療儀器有限公司；MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；THZ-35高速恒溫培養搖床，蘇州貝茵科技股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 固體培養基篩選

選取朵形端正、健壯、色澤好、肉質飽滿的花臉香蘑子實體，通過無菌操作將子實體縱剖，在花臉香蘑子實體上劃3mm×3mm×3mm大的不同的4個位置的塊狀組織，用接種鉤勾取置培養基中央，用封口膜封住平皿，以防失水，置于25℃恒溫培養箱中進行初步的避光培養。用打孔器在初步培養后的培養基上取生長速度、顏色和大小相同的菌絲塊接種至3種不同的固體培養基中進行培養，每日觀察并記錄，直至菌絲長至培養皿邊緣。用電子萬用爐將3種固體培養基內瓊脂煮沸溶解，使菌絲體與瓊脂分離，用無菌紗布進行過濾。將菌絲放在預先干燥稱量恒重后的稱量皿中，放置于80℃狀態下烘干，取出后冷卻稱量至恒重。根據花臉香蘑菌種在3種固體培養基上的菌絲長勢和菌絲干質量篩選出最優固體培養基配方。

1.4.2 液體培養基篩選

在篩選出的最優固體培養基上，選取菌絲長勢、顏色相似位置，用打孔器取16個大小均一的菌塊，4個菌塊為1組，分別接種于100mL 3種不同液體培養基中，并放入搖床中，于150r·min-1，25℃條件下培養5d。將培養好的液體培養基中的菌絲球放在紗布上過濾，用無菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷卻至室溫稱重，利用公式計算菌絲體生物量[19]。根據菌絲體生物量篩選出最優液體培養基配方。公式：

菌絲體生物量(g·L-1)=菌絲體干重/培養液體積

1.4.3 花臉香蘑菌種栽培馴化

先將高粱沖洗提前用水浸泡16h，加水煮沸至高粱粒軟而不爛，瀝干水分，以高粱的干重為基準，依次加入石膏、麥麩和木屑，同時按配方比例加入KH2PO4和MgSO42種營養素混合水溶液，用生石灰調pH至7左右，翻攪均勻，用組培瓶裝料至瓶2/3處，瓶口覆封口膜，壓緊瓶蓋，121℃滅菌2h后取出，在超凈工作臺內冷卻后，無菌操作下，將滅菌后組培瓶中的栽培基料上下翻攪均勻，將篩選出的最優液體培養基按照培養基重量的3%接種，并置于25℃的恒溫箱中培養。觀察并記錄其生長狀態、菌瓶減少的重量和菌絲吃料深度，從而評價花臉香蘑在栽培種培養基上的生長狀態。

2 結果與分析

2.1 花臉香蘑菌種固體培養基的篩選結果

以PDA、PDA加富及改良PDA 3種固體培養基對分離的花臉香蘑菌絲體進行培養，連續觀測記錄菌絲在固體培養基上的生長狀況，見圖1、表1，并通過菌絲干質量和菌絲長度的統計分析篩選出最適合花臉香蘑菌種生長的固體培養基配方，結果見圖2、圖3。通過觀察菌絲長勢和測量菌絲長度發現，菌絲在3種固體培養基上均能很快萌發，菌絲茂密整齊。但隨著培養時間的延長，在培養至第18天時，PDA培養基上的菌絲率先長滿培養皿，而PDA加富培養基與改良PDA培養基上菌絲生長略慢，在培養至第20天時，也已全部長滿培養皿，因此在3種培養基上整體長勢無顯著差異。

注：A表示PDA培養基；B表示PDA加富培養基；C表示改良PDA培養基。

表1 花臉香蘑菌種在3種固體培養基上的菌絲生長狀況

圖2 花臉香蘑菌種在3種固體培養基上的菌絲長度

通過對3種固體培養基進行菌絲干質量比較，見圖3，PDA加富培養基上的菌絲干質量最大，為0.17±0.02g，其次是改良PDA培養基的菌絲干質量，為0.12±0.01g，而在PDA培養基上的菌絲干質量最小，為0.11±0.03g，由此說明，雖然在PDA培養基上的菌絲生長速度較快，且菌絲較濃密，但在PDA加富培養基上的的菌絲干質量積累較多。綜合以上實驗數據分析，確定PDA加富培養基為花臉香蘑菌種的最優固體培養基配方。其他研究學者，如陸歡等研究報道，花臉香蘑在PDA和含麥粒的瓊脂培養基均上長勢旺盛，菌絲粗壯、致密，爬壁能力較強，菌絲呈紫色或淺紫色，絨毛狀[22]。

2.2 花臉香蘑菌種液體培養基的篩選結果

選用3種常見不同配料的液體培養基，并以菌絲體生物量為評價指標，對花臉香蘑最佳液體培養基進行篩選，結果見圖4。由圖4可知，花臉香蘑菌種在液體培養基1、液體培養基2、液體培養基3 3種液體培養基上的菌絲生物量分別為1.68±0.13g·L-1、1.58±0.10g·L-1、1.06±0.11g·L-1，其中在液體培養基1上菌絲生物量最高，液體培養基3上的菌絲生物量最小。通過菌絲體生物量的比較分析，最終確定液體培養基1為花臉香蘑菌種的最佳培養基配方。目前，花臉香蘑液體發酵技術相對成熟，主要對搖瓶發酵條件的優化研究較多，對花臉香蘑液體發酵培養的影響因素通過正交實驗法探索得到最優組合。崔曉等以菌絲生物量為主要指標，通過對馬鈴薯、玉米粉、麩皮、葡萄糖、酵母膏含量進行配比，從這5種不同液體培養基中篩選出了適宜菌絲生長的液體培養基，其菌絲生物量達到2.209g·L-1[23]。這與本研究篩選的液體培養基1的生物量相近。

圖3 花臉香蘑菌種在3種固體培養基上的菌絲干質量

圖4 花臉香蘑菌種在3種液體培養基上的菌絲干質量

2.3 基于高粱培養基的花臉香蘑栽培種研制

本研究通過觀察并記錄花臉香蘑在栽培種培養基上的生長狀態、菌瓶內有機物變化量和菌絲吃料深度，從而評價花臉香蘑菌種的栽培馴化，結果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6可知，花臉香蘑菌絲長勢在栽培種培養基上呈現先快后慢的現象，菌絲在經過2d的避光培養，瓶內已出現清晰可見萌發的菌絲團，在第8天時菌絲體已生長至培養基質的1/2，隨后生長逐漸減緩，至第24天時接近長滿，此時菌絲吃料深度達8.12±1.7cm，可觀察到少部分紫色色素和大部分白色菌絲體。通過菌瓶重量變化曲線可知，菌瓶隨著培養時間的延長重量變化量逐漸增大，這是由于菌絲體腐生生長需大量消耗有機物質，當至24d時，菌瓶重量已減少了7.81±1.83g。綜上試驗數據分析，花臉香蘑菌絲在高粱培養基中生長狀態良好，培養基能供應其基礎營養物質。

圖5 花臉香蘑菌種在高粱二級種培養基中的生長狀態

圖6 花臉香蘑在高粱二級種培養基減少的重量

3 結論與討論

本文通過對花臉香蘑固體培養基和液體培養基選的篩選研究表明，確定PDA加富培養基為花臉香蘑菌種的最佳固體培養基配方，培養至20d后菌絲干質量達0.17±0.02g；通過菌絲體生物量的比較分析，確定液體培養基1為花臉香蘑菌種的最佳培養基配方，其菌絲生物量為1.68±0.13g·L-1。通過觀察并記錄花臉香蘑在栽培種培養基上的生長狀態、菌瓶內有機物變化量和菌絲吃料深度，確定花臉香蘑菌絲在高粱培養基中生長狀態良好，培養基能供應其基礎營養物質。本研究所選用的培養基配方均以常見食用菌培養配方為基礎，并進行了初步改良，因此，所篩選花臉香蘑固體培養基、液體培養基及栽培種培養基最佳配方，只作為初步篩選階段，后續還需對培養基中的具體營養成分比例及培養條件進行優化，進一步完善論證實驗研究結果，以期為野生花臉香蘑優良菌種篩選和后續育種提供有力數據。