高甘油三酯對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子的影響

蒲麗君，劉杰，胡厚祥

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管疾病研究室，四川 南充 637000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS )是一種血管壁的慢性炎性疾病，是各種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)作為動(dòng)脈壁的主要成分，其凋亡[2]和炎癥反應(yīng)[3]在AS的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用 。血脂異常與AS密切相關(guān)，其中高甘油三酯(HTG)是最常見的脂代謝異常。AS與甘油三酯(TG) 的代謝異常息息相關(guān)，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD) 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有重要作用。但TG與ASCVD確切關(guān)系仍有爭(zhēng)議，其機(jī)制尚未清楚。既往研究[4]指出中鏈甘油三酯對(duì)VSMCs增殖具有雙向作用，但HTG對(duì)于VSMCs凋亡和炎癥因子的影響目前研究較少。因此，本研究以HASMC 為研究對(duì)象，觀察HTG對(duì)HASMC凋亡和炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HASMC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。甘油三酯(G1904231)購(gòu)自Bomei，DMEM高糖培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MTT購(gòu)自Biofroxx公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，放射性免疫沉淀評(píng)價(jià)(radio immunoprecipitation assay，RIPA)細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定購(gòu)自碧云天公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)自Affinity公司，兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(A0208)、兔抗人胱天蛋白酶-3(Caspase-3，A0214)及兔抗人β-actin(AC026)抗體購(gòu)自ABClone公司，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(ab6721)購(gòu)自美國(guó)abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

將人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells，HASMC)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為TG 1 mmol/L組、2.5 mmol/L組和5 mmol/L組，實(shí)驗(yàn)組分別采用TG 1.0 mmol/L、2.5 mmol/L和5.0 mmol/L刺激細(xì)胞24 h。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rat aortic smooth muscle cell，RASMC)接種于 96 孔板(5×104個(gè)/孔),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，室溫避光孵育 5 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值 )/(對(duì)照組OD值-空白組OD 值)]×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMC接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，設(shè)置組別對(duì)照組、1 mmol/一組、2.5 mmol/一組、5 mmol/一組，每組重復(fù)3次，干預(yù)24 h后，將上清液吸入15 mL離心管中，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞1次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化收集細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞液移入1.5 mL EP管中，離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌兩次，用500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin APC輕輕吹勻，再加入5 μL的碘化丙錠(PI)混勻；室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)分析。

1.5 Western blot 檢測(cè)Bcl-2和 Caspase-3 蛋白表達(dá)

HASMC干預(yù)24 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后通過蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。每個(gè)樣品以20 μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)膜上，用 5% 脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶2 000)和β-actin(1∶100 000)，在4 ℃ 搖床上孵育過夜，以用Tris-Hcl- NaCl-Tween 20緩沖液(TBST)將PVDF膜洗3次，每次5 min，將PVDF膜放入二抗(1∶5 000)中，搖床上輕搖，室溫孵育2 h，用TBST再洗膜3次，每次5 min。用ECL發(fā)光劑顯影。再用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以Bcl-2/β-actin和Caspase-3/β-actin的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用 ELISA 法檢測(cè)IL-6、TNF-α 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TG對(duì)HASMC細(xì)胞增殖抑制的影響

與對(duì)照組比較，TG 1 mmol/L組抑制增殖率降低(P<0.05)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組增殖抑制率增加(P<0.05)，呈濃度依賴性。與TG 1 mmol/L組比較，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組增殖抑制率增加(P<0.05)，呈濃度依賴性。與 TG 2.5 mmol/L比較，TG 5 mmol/L組增殖抑制率增加(P<0.05)。見表1。

2.2 TG對(duì)RASMC凋亡的影響

與對(duì)照組比較，TG 1 mmol/L組凋亡率降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組凋亡率增加(P<0.05)，且TG 5 mmol/L組凋亡率高于TG 2.5 mmol/L組(P<0.05)； 與TG 1 mmol/L組比較， TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組凋亡率增加(P<0.05)。見表1及圖1。

2.3 TG對(duì)Bcl-2、 Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，TG 1 mmol/L組中Bcl-2蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與TG 1 mmol/L比較，TG 2.5 mmol/L組中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5 mmol/L組中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較， TG 1 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L組中Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與TG 1 mmol/L組比較，TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組中Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與TG 2.5 mmol/L比較，TG 5 mmol/L組中Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖2及表2。

表1 不同組別細(xì)胞凋亡結(jié)果比較

表2 各組Bcl-2、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 TG對(duì)炎癥因子IL-6和TNF-α水平影響

與對(duì)照組相比，TG 1 mmol/L組上清液中IL-6和TNF-α濃度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而TG 2.5 mmol/L和5 mmol/L組中IL-6和TNF-α濃度均升高(P<0.05)；與TG 2.5 mmol/L比較，TG 5 mmol/L組中IL-6和TNF-α濃度升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α濃度比較

3 討論

AS是各種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人類健康，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。VSMCs作為血管中膜的主要細(xì)胞類型之一，其增殖和凋亡的平衡貫穿AS全過程[5]。既往研究[6-8]多聚焦于VSMCs的增殖與遷移，而近年來，越來越多的研究表明AS的形成過程也與VSMCs等細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[9]。Clarke等[10]指出，對(duì)小鼠血管中膜和內(nèi)膜的 VSMCs 進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)后，AS斑塊中出現(xiàn)纖維帽變薄、細(xì)胞碎片堆積和內(nèi)膜炎癥等現(xiàn)象，VSMCs凋亡與AS斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)。AS患者的 VSMCs凋亡率高，與粥樣斑塊不穩(wěn)定有關(guān)[11]。但是VSMCs凋亡與AS形成的具體機(jī)制尚未清楚。因此，深入研究其凋亡調(diào)控機(jī)制有望為AS的預(yù)防和治療提供新的參考靶點(diǎn)。

HTG是臨床上常見的一個(gè)全球性公共健康問題，它對(duì)各種心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展都起著重要的作用。HTG是否是致AS和冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是近年來該領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，目前仍存在有爭(zhēng)議。HTG血漿可促進(jìn)VSMCs的增殖，減少凋亡[12-13]；但中鏈甘油三酯對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖具有雙向作用[4]，即在低濃度短時(shí)間促進(jìn)增殖作用，在中、高濃度抑制增殖作用，且凋亡可能與中鏈甘油三酯的抑制細(xì)胞增殖作用無關(guān)。Bcl-2/Casepas-3信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中至關(guān)重要，Bcl-2具有抗凋亡作用，Caspase-3活化后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且Bcl-2抑制Caspase-3的活性以減少細(xì)胞凋亡。本研究顯示，中、高濃度TG可通過促進(jìn)Casepas-3表達(dá)并抑制Bcl-2表達(dá)來促進(jìn)HASMC凋亡，且具有濃度依賴性，但低濃度TG對(duì)HASMC凋亡無明顯影響，即便其可促進(jìn)HASMC增殖，究其原因可能與AS晚期斑塊不穩(wěn)定及炎癥因子浸潤(rùn)等因素有關(guān)。

此外，炎癥在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。TNF-α又稱為前炎癥細(xì)胞因子，是啟動(dòng)炎性反應(yīng)最為重要的細(xì)胞因子，IL-6是一種具有多重效應(yīng)細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫代謝過程中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高濃度TG可上調(diào)炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，并且呈濃度依賴性，與既往研究[15-17]基本一致，TG促使AS病變晚期HASMC凋亡增加與炎癥反應(yīng)的程度有關(guān)。

綜上，中、高濃度TG可通過促進(jìn)Casepas-3表達(dá)及并抑制Bcl-2表達(dá)來促進(jìn)HASMC凋亡，且具有濃度依賴性。