一種新型擬除蟲菊酯類農藥半抗原的設計合成及其效果評價

楊星星，付 輝*，王炳志，李細清，張 鑫，嚴義勇，王幸幸

(1.深圳市易瑞生物技術股份有限公司，廣東深圳 518101；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518038)

擬除蟲菊酯類農藥由于其高效低毒被廣泛用于蔬菜、水果、農作物、林業的害蟲防治。然而，隨著擬除蟲菊酯類農藥長期大量的使用，其原藥本體及代謝物殘留危害日益明顯，現已引起世界各國研究者的極大關注[1-2]。目前，檢測擬除蟲菊酯殘留最常用的方法是氣相色譜法，此外，高效液相色譜法、毛細管電泳法、質譜-色譜聯用技術等[3-11]也都可用于擬除蟲菊酯殘留的檢測，但這些儀器分析法對樣品基質要求高，往往需要復雜的前處理，不僅耗時費錢，而且會造成痕量擬除蟲菊酯的損失；再加上這些儀器分析方法無法滿足低成本、高通量、快速檢測和現場檢測的要求。免疫分析法由于前處理簡單、使用方便等優點正好可以彌補這些不足，因此建立擬除蟲菊酯的免疫檢測技術具有很好的發展前景和市場潛力。

建立擬除蟲菊酯免疫檢測方法的關鍵是制備親和力強和高靈敏度的抗體，而重點在于半抗原的設計合成。一直以來，由于對抗原抗體作用機理以及半抗原空間結構的了解不足，導致半抗原設計具有很大的盲目性，通常需要反復多次的試錯嘗試，耗費了大量的資金和時間。而且對于非有機合成專業的人員來說，對目標物進行有機修飾或從頭合成半抗原，往往非常困難。另外，擬除蟲菊酯是一類典型的手性農藥，含有多個旋光異構單體，這對于能夠識別手性單體的抗體而言，一種菊酯往往是多種物質的混合物，增大了免疫分析的難度。目前針對擬除蟲菊酯半抗原的合成主要有全合成在苯環上衍生手臂[12-14]、在菊酯的氰基上衍生手臂，這些方法制備的半抗原手性結構會有很多種，而對半抗原進行手性分離又是非常困難的事；有的甚至只使用菊酯的部分結構[15-16]，導致免疫獲得的抗血清競爭不理想。為了能夠有效地獲得高質量擬除蟲菊酯的抗體，筆者經過多次嘗試成功運用擬除蟲菊酯原藥為原料，在不改變菊酯整體結構情況下，經過幾步簡單的合成，制備出與原藥手性結構一樣的農藥半抗原單體；并對幾種擬除蟲菊酯的抗血清進行性能測試，能夠滿足一定的要求，為后續進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1主要試劑。氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯原藥購自成都溫江試劑；二甲硫醚、三苯基磷乙酸叔丁酯、無水四氫呋喃、三氟乙酸、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、液溴購于上海安耐吉試劑公司；卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)、牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、弗氏佐劑購自美國Sigma 公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自北京Solarbio生物有限公司；擬除蟲菊酯類農藥標準品購自北京壇墨質檢；包被液、稀釋液、洗滌液、封閉液、TMB 底物溶液、終止液均參考文獻[17]配制。

1.1.2實驗動物。Balb/c小鼠，雌性，8～9周齡，體重 20～22 g(廣東省醫學動物實驗中心)。

1.1.3儀器。DHJF-8002 低溫恒溫攪拌反應浴(鄭州長城科工貿有限公司)；旋轉蒸發儀(日本愛朗公司)；酶標板自動洗滌機(美國，Bio-tech)；API 3000液質聯用儀(美國，AB)；酶標儀(美國，Thermo)；臭氧發生器(廣州奧普發環保科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1半抗原的合成。稱取10 mmol擬除蟲菊酯原藥(氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯)，用30 mL二氯甲烷溶解后轉移至冷阱中，在-78 ℃下通入預干燥并預冷卻的臭氧6 h(臭氧通過臭氧發生器制備，產氣量為20 g/h)。反應完成后通入預干燥并預冷卻的氮氣15 min，再加入70 mmol二甲硫醚，-78 ℃通入氮氣鼓泡反應30 min后取出，蒸干溶劑，過柱純化得無色油狀物JZ-1。

將12 mmol三苯基磷乙酸叔丁酯溶于30 mL二氯甲烷，在冰水浴下通入氯氣直到體系變黃綠，停止氯氣(注：若是制備溴氰菊酯半抗原則是直接加入液溴)，繼續攪拌過夜，反應完成后旋干后無需后處理直接用，即得到JZ-2。

取4.0 mmol JZ-1再加入6.0 mmol JZ-2，用無水四氫呋喃20 mL與二氯甲烷3 mL溶解。室溫攪拌反應4 h，反應完成后加適量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有機相，蒸干后過柱純化，得到無色油狀物JZ-3。

稱取1.5 mmol JZ-3溶于6 mL二氯甲烷，再加入3 mL三氟乙酸，室溫攪拌反應1 h，反應完成后旋蒸除去溶劑，加乙酸乙酯30 mL，用檸檬酸-檸檬酸鈉飽和溶液洗滌2次，再用水洗滌2次，最后用飽和食鹽水洗滌1次，有機相干燥后旋干，得白色固體即菊酯半抗原，分別編號為JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4，具體合成路線和結構見圖1和表1。

注：R1、R2為H、Cl、Br、F3C-；R為菊酯其他帶有苯環結構；X為Cl、Br。 Note：R1 and R2 are H，Cl，Br and F3C-；R is pyrethroid and others have benzene ring structure；X is Cl，Br.圖1 擬除蟲菊酯半抗原合成路線Fig.1 Synthesis route of pyrethroid hapten

表1 4種擬除蟲菊酯半抗原結構

1.2.2人工抗原的合成。采用活潑酯法將合成的擬除蟲菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4分別與載體蛋白BSA 相偶聯，制備菊酯人工免疫抗原。具體步驟：稱取1 mmol半抗原、1.1 mmol N-羥基琥珀酰亞胺、1.2 mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，加入0.5 mL DMF溶解，在磁力攪拌下室內溫度進行反應8 h。反應結束后吸取0.2 mL，緩慢滴加到3 mL 10 mg/mL 的 BSA 碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)/DMF(2∶1，v/v)混合液中，在磁力攪拌下室溫反應6 h。將反應液置于透析袋內，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中攪拌透析，每 4～8 h 換1 次透析液，共透析72 h。透析結束后將透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分裝于 1 mL 離心管中，分別編號JZ-H1-BSA、JZ-H2-BSA、JZ-H3-BSA、JZ-H4-BSA，于-20 ℃冰箱中存放備用。

采用混合酸酐法制備包被原，具體步驟：將1 mmol菊酯半抗原溶于 0.5 mL DMF，冰浴下，加入1.2 mmol三丁胺、1.2 mmol氯甲酸異丁酯，室溫避光攪拌反應 60 min，得到的混合酸酐溶液緩慢滴加到3 mL 20 mg/mL 的 OVA PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)/DMF(2∶1，v/v)混合液中，室溫磁力攪拌反應 3 h，將反應液置于透析袋內，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中攪拌透析，每 4～8 h 換1 次透析液，共透析72 h。透析結束后將透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分裝于 1 mL 離心管中，分別編號JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA，于-20 ℃冰箱中存放備用。

1.2.3抗血清制備。選取12 只8 周齡的 Balb/c 雌性小鼠分為4組，每組(編號分別為 1 號、2 號、3 號小鼠)首先是尾部采血取血清作為陰性血清，之后進行免疫，免疫4次，每次免疫間隔21 d，第4次免疫后7 d，挖眼采集血清100 μL，冰箱過夜，10 000 r/min離心 10 min，得到菊酯鼠多抗血清。

1.2.4抗血清效價和靈敏度測定。將包被原JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA用碳酸緩沖液稀釋至所需濃度包被后，抗血清效價的測定采用間接非競爭 ELISA 操作程序，抗血清靈敏度的測定采用間接競爭ELISA 操作程序，具體程序參照文獻[18] 。

2 結果與分析

2.1 半抗原的鑒定將“1.2.1”合成的4種擬除蟲菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4采用質譜進行測定，檢測在負離子模式下進行，如圖2所示。從圖2可以看出，這些半抗原均可得到分子離子峰 [M-H]-以及倍峰 [2M-H]-；JZ-H1分子離子峰 424.4[M-H]-，倍峰849.5 [2M-H]-；JZ-H2分子離子峰 399.4[M-H]-，倍峰799.7[2M-H]-；JZ-H3分子離子峰 442.6[M-H]-，倍峰885.5[2M-H]-；JZ-H4分子離子峰470.6[M-H]-，倍峰939.6 [2M-H]-；這些峰均與其對應化合物的分子量相符(表1)，說明這些半抗原合成成功。

圖2 4種擬除蟲菊酯半抗原質譜圖Fig.2 The MS of four pyrethroid haptens

2.2 人工抗原的鑒定將菊酯半抗原分別與載體蛋白偶聯后，制備獲得包被抗原和免疫抗原，通過紫外掃描獲得相應的紫外吸收光譜(圖3)。從圖3可以看出，偶聯物的紫外吸收均發生明顯變化，表明半抗原與載體蛋白偶聯成功。

圖3 免疫抗原和包被抗原紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of immune antigen and coating antigen

2.3 抗血清效價和靈敏度測定由間接非競爭 ELISA 法測定4種藥物產生的抗血清，經過4次免疫，抗血清的效價均達到15 000倍以上(表2)，說明被免疫的小鼠產生了抗體。

表2 各小鼠免疫效價Table 2 Immune titers of mice

在這4類藥物抗血清中，每種選擇效價較高的小鼠抗血清利用競爭ELISA 法進行抗體靈敏度檢測。以0.2 mg/mL 濃度的JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA包被原分別包被酶標板，分別配制 0、0.000 1、0.001 0、0.100 0、1.000 0、10.000 0、100.000 0 mg/L 7個梯度的菊酯標準溶液(含 10%甲醇，pH 7.2)。每孔依次加入 50 μL 待測菊酯標準溶液、50 μL 抗血清(氯氰菊酯稀釋20 000倍、氯菊酯稀釋25 000倍、氟氯氰菊酯稀釋25 000倍、溴氰菊酯稀釋30 000倍)。間接競爭ELISA 法的抑制曲線如圖4所示。從圖4可以看出，4種抗血清均有競爭，隨著各菊酯標準品用量的增加，抑制率會逐漸升高；在1 mg/L時除了溴氰菊酯的抑制率低于50%，其余均高于50%，這說明血清中的抗體和各菊酯發生了特異性結合反應，抗血清中存在針對菊酯的特異性抗體，直接證明了制備的各菊酯人工抗原合成成功。

圖4 各菊酯的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of each pyrethroid

3 討論

有關擬除蟲菊酯類農藥的免疫檢測已經有很多學者進行了報道，菊酯類農藥免疫檢測的一大難點就是設計合成其半抗原，現有研究一般采用全合成的方法進行制備，而由此帶來的問題是合成的半抗原會有很多手性結構，導致免疫結果不理想，制備的抗體往往有滴度而沒有競爭。 該研究首次以4種擬除蟲菊酯為事例，采用原藥經臭氧氧化、氯代反應、維悌希反應、水解4步化學反應合成半抗原，沒有改變藥物的手性結構，最大限度地保留藥物本身的官能團，這樣制備的抗體才能有較高的靈敏度和特異性。