羊肉中貉源成分Real-time PCR檢測(cè)方法的建立

張 誼，湯思凝，梅汝蕃，郝立武，張書宏，王秋悅，鄭百芹*

(1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山 063000；2.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北秦皇島 066000)

我國是羊肉產(chǎn)量大國，羊肉消費(fèi)呈逐年增長的趨勢(shì)，但摻假問題一直是影響羊肉消費(fèi)的關(guān)鍵問題，尤其是動(dòng)物源性食品摻假是最常見也是最難鑒別的嚴(yán)重問題[1-2]。我國毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物貉子養(yǎng)殖量大，每年會(huì)產(chǎn)出大量的貉子廢棄肉，貉子胴體有可能成為羊肉摻假中一類。截至目前，已經(jīng)開發(fā)了許多肉類摻假檢測(cè)的檢測(cè)技術(shù)，包括Real-time PCR(qPCR)檢測(cè)技術(shù)、近紅外特征光譜技術(shù)、高光譜法、分光光度法和酶聯(lián)免疫分析法等[3-12]。這些檢測(cè)方法中，Real-time PCR特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、成本更低，該方法在肉類摻假方面的應(yīng)用已日趨成熟[13-18]。該研究利用Real-time PCR，建立一種對(duì)貉肉源成分的快速檢測(cè)方法，以期對(duì)羊肉及其肉制品中貉肉源的摻假進(jìn)行定性及定量的檢測(cè)，為量化羊肉成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉購自秦皇島某大型超市；羊肉、貉肉、狐貍?cè)狻Ⅴ跞庥珊颖笔☆A(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；吸附柱法動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒、磁珠法動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購自北京天根科技有限公司；瓊脂糖、DL2000 DNA Marker、2×ESTaqMasterMix(Dye)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備NanoDrop 2000核酸蛋白定量?jī)x(美國Thermo Scientific公司)；DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；高速離心機(jī) FC5515R(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī) TGL-16G(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Mx3000P Agilent(美國安捷倫Stratagene公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的制備。分別取豬、牛、羊、雞、鴨、狐貍、貉、貂8種動(dòng)物的鮮肉組織樣本各1 g，放在高壓滅菌處理過的研缽中進(jìn)行液氮研磨，研成肉末后轉(zhuǎn)移至凍存管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2基因組DNA的提取。分別稱取100 mg 8種動(dòng)物組織肉末，按組織基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3DNA濃度純度檢測(cè)。用NanoDrop 2000核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定核酸濃度與純度，記錄A260/A280及A260/A230值；并將DNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)其完整性。

1.3.4PCR引物設(shè)計(jì)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-23]，根據(jù)貉子線粒體cytB基因序列，并使用NCBI Blast、MEGA 7等軟件將貉源cytB基因與豬、牛、羊、雞、鴨、狐貍、貂物種序列進(jìn)行比對(duì)，篩選不同種物種間差異序列，設(shè)計(jì)特異性引物。選擇較為保守的基因16S rDNA為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)通用引物。引物序列如表1所示。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，模板DNA 1.0 μL。預(yù)試驗(yàn)中在46～54 ℃設(shè)置了梯度PCR，最后確定了50 ℃為退火溫度，其擴(kuò)增效果最佳。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 特異性引物和通用引物序列Table 1 Specific primer and universal primer

1.3.6特異性引物和通用性引物檢測(cè)。將提取8個(gè)物種基因組DNA進(jìn)行稀釋，濃度均為50 ng/μL，分別使用特異性引物cytB及通用引物16S rDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，ddH2O為陰性對(duì)照。根據(jù)所得曲線圖及Ct值分析cytB引物的特異性和16S引物通用性。

1.3.7引物靈敏度檢測(cè)。將初始濃度為50 ng/μL的貉DNA樣本進(jìn)行5倍梯度稀釋，使其終濃度分別為50.0 ng/μL、10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、400.0 pg/μL、80.0 pg/μL、16.0 pg/μL、3.2 pg/μL，分別以其為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，ddH2O為陰性對(duì)照。根據(jù)曲線圖及Ct值分析特異性cytB引物所能擴(kuò)增的最低檢測(cè)濃度。

1.3.9標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性驗(yàn)證。以總質(zhì)量為100 mg，貉肉含量分別為5%、15%、45%、65%和95%的貉羊混合肉進(jìn)行DNA提取后，統(tǒng)一稀釋為50.0 ng/μL，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。將ΔCt值帶入已建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算羊肉質(zhì)量百分比及其回收率，16S rDNA作為內(nèi)參，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。

1.3.10檢測(cè)方法的穩(wěn)定性評(píng)估。取終濃度分別為400.0、80.0、3.2 pg/μL的貉DNA樣本，以其為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)。每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，記錄各濃度在檢測(cè)體系的Ct值，并計(jì)算其變異系數(shù)，以評(píng)估檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度和純度測(cè)定不同肉類DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果見表2。按核酸提取要求，無蛋白質(zhì)污染的核酸溶液A260/A280>1.8，無碳水化合物污染的核酸溶液A260/A230>2.0。測(cè)定結(jié)果(表2)顯示，提取的各類肉DNA純度和濃度均達(dá)到要求，模板DNA質(zhì)量較好，無蛋白及雜質(zhì)污染，可用于后續(xù)qPCR檢測(cè)。

表2 DNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of DNA concentration and purity

不同肉類基因組DNA電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。電泳條帶清晰、完整，說明提取的基因組DNA可用于后續(xù)qPCR檢測(cè)。

注：M為mark。圖1 各種肉類基因組DNA提取結(jié)果電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA extraction results of various meats

2.2 引物cytB特異性及16S通用性檢測(cè)結(jié)果以cytB作為特異性引物，分別以豬、牛、羊、雞、鴨、貉、狐貍和貂基因組DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。如圖2所示，8種畜禽肉中，只有貉肉DNA在第17個(gè)循環(huán)處開始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期，而其余6種在第27個(gè)循環(huán)處才開始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期，可以很好地與其他幾個(gè)常見物種區(qū)分，表明cytB引物特異性較強(qiáng)，符合試驗(yàn)要求。

圖2 特異引物cytB對(duì)不同肉類DNA的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of specific primer cytB on different meat DNA

內(nèi)參引物16S對(duì)8種畜禽肉均有較好的擴(kuò)增效率，且內(nèi)參基因16S rDNA 檢測(cè)的Ct值均集中在狹窄范圍內(nèi)，較為穩(wěn)定(圖3)，表明其具有通用性。

圖3 內(nèi)參引物16S對(duì)不同物種肉DNA的擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curve of meat DNA of different species by internal reference primer 16S

圖4分別為特異性引物和通用引物的擴(kuò)增熔解曲線，特異性引物擴(kuò)增熔解曲線峰值溫度為85.65 ℃，通用引物峰值溫度為84.25 ℃，2個(gè)熔解曲線均為規(guī)則特異性單峰，無雜峰，說明試驗(yàn)所用2個(gè)引物均無二聚體產(chǎn)生且特異性較強(qiáng)，符合檢測(cè)要求。

2.3 引物靈敏度檢測(cè)以不同濃度貉基因組DNA為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)判斷其最低檢測(cè)限，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)模板濃度為0.64 pg/μL時(shí)，cytB引物擴(kuò)增曲線與陰性對(duì)照無酶水?dāng)U增曲線不能明確區(qū)分；而當(dāng)模板濃度為3.2 pg/μL時(shí)，特異引物指數(shù)擴(kuò)增曲線可與其他濃度曲線準(zhǔn)確明顯區(qū)分，因此該引物的最低檢測(cè)限為3.2 pg/μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立不同比例貉羊混合肉樣實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果如表3所示。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。以貉子肉質(zhì)量百分比的log10值為橫坐標(biāo)、ΔCt為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，得出回歸方程為Y=-4.212X-0.636 4(R2=0.988 9)，且擴(kuò)增效率(E)為97.86%，符合《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)-MIQE指南》中E<105%的標(biāo)準(zhǔn)，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，滿足實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)的要求。

圖4 特異性引物(a)和通用引物(b)擴(kuò)增熔解曲線Fig.4 Melting curve of amplification with specific primers (a) and universal primers(b)

圖5 引物cytB對(duì)不同濃度DNA的擴(kuò)增曲線Fig.5 Amplification curves of primer cytB on DNA gradients of different concentrations

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性驗(yàn)證分別以質(zhì)量比為5%、15%、45%、65%、95%的貉羊混合肉樣為模板，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，Ct值結(jié)果如表4所示。將ΔCt值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-4.212X-0.636 4，計(jì)算出貉肉的含量及其回收率，由表4可知其回收率為97.71%～104.36%。試驗(yàn)結(jié)果符合要求，具有實(shí)踐意義。

2.6 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性評(píng)估為了檢測(cè)該方法穩(wěn)定性，該研究分別做了組內(nèi)及組間重復(fù)各3組，每組3個(gè)重復(fù)。重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果見表5，組內(nèi)變異系數(shù)為0.13%～0.59%，組間變異系數(shù)為0.04%～1.08%，表明檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性。

表3 不同質(zhì)量百分比貉肉Ct以及ΔCt值檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of raccoon dog meat mass percentage Ct and ΔCt values

3 討論與結(jié)論

肉類摻假中最常見的手段是使用廢棄肉或低品質(zhì)的肉類替代高品質(zhì)昂貴的肉類，我國貉養(yǎng)殖量巨大，每年都會(huì)產(chǎn)生大量的貉廢棄肉，這些肉往往容易被摻入到價(jià)格更高的羊肉中去，因此對(duì)羊肉中摻入貉源成分的檢測(cè)方法的開發(fā)尤為重要。該試驗(yàn)為檢測(cè)羊肉中貉源成分的含量，建立Real-time PCR的方法，以cytB基因?yàn)樘禺愋詸z測(cè)引物，構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，檢測(cè)結(jié)果表明在模擬摻假肉中樣品回收率為97.71%～104.36%，最低檢測(cè)限達(dá)3.2 pg/μL。董洋洋[24]通過實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)牛肉中的鴨肉和豬肉成分進(jìn)行了鑒定，其檢測(cè)限分別達(dá)0.20 和0.02 ng。姜潔等[25]對(duì)羊肉中豬源成分和雞源成分進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示其質(zhì)量檢測(cè)百分比的絕對(duì)誤差可以控制在7%以內(nèi)。薛晨玉等[26]對(duì)羊肉中雞源成分的量化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)百分比與理論百分比間的絕對(duì)誤差在5%以內(nèi)。該研究所建立的方法抗干擾能力較強(qiáng)，可有效地檢測(cè)出羊肉中的貉源成分，量化研究結(jié)果準(zhǔn)確。

圖6 混合貉肉含量ΔCt標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Mixed raccoon dog meat content ΔCt standard curve

由于羊肉制品在加工過程中其DNA質(zhì)量會(huì)受到不同程度的損耗，因此選擇一種高質(zhì)量的核酸DNA提取方法至關(guān)重要。在試驗(yàn)過程中分別采用常見組織DNA提取方法，包括試劑盒吸附柱法、試劑盒磁珠法、SDS法、氯仿-醋酸鈉法、苯酚-氯仿抽提法。通過對(duì)提取DNA的完整性、濃度、純度、試驗(yàn)耗時(shí)、耗材等方面比較得出，試劑盒法更適合用于常見動(dòng)物源性肌肉DNA的提取。相比較試劑盒吸附柱法和試劑盒磁珠法，前者提取的核酸濃度高，糖類雜質(zhì)少，DNA提取率更高。

表4 模擬混合肉樣Ct值檢測(cè)結(jié)果Table 4 Ct value of simulated mixed meat sample

表5 組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Repetitive experimental results within and between groups

該研究拓展了羊肉中動(dòng)物源性成分檢測(cè)的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了在基因水平對(duì)貉肉成分的量化判定，為羊肉摻假工作的檢驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。今后將進(jìn)一步研究羊肉摻假中多種肉源成分鑒定的方法，為羊肉制品摻假的檢測(cè)提供更為簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)手段和執(zhí)法依據(jù)，以滿足市場(chǎng)需求。