飼料中添加不同水平的雞腸粉對鯉腸道菌群結構的影響

彭祖想，嚴 林，衛力博，高 欣，王悅晗，翟浩杰，任同軍，王 偉，2，韓雨哲，2*

(1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連 116023；2.大連海洋大學遼寧省北方魚類應用生物學與增養殖重點實驗室，遼寧大連 116023)

近年來由于魚粉資源的匱乏和高昂的價格導致魚粉資源的不穩定性，限制了水產養殖行業的可持續發展。當今迫切需要開發一種蛋白含量高、價格低廉、易獲得且供應穩定的新型飼料蛋白源以滿足水產飼料行業的需求。雞腸粉是家禽副產品粉(poultry by-product meal，PBM)的一種，是以新鮮雞腸為原料，經沖洗、蒸煮、噴霧干燥和粉碎等工序加工而成的新型優質飼料蛋白源。優質的雞腸粉粗蛋白和粗脂肪含量與魚粉接近，部分必需氨基酸含量甚至高于魚粉，從營養成分及氨基酸組成分析，雞腸粉是一種較有潛力的優質動物蛋白[1]。目前國內對雞腸粉的研究較少，筆者所在實驗室前期的研究表明，雞腸粉能夠完全替代鯉飼料中的魚粉，不會對鯉生長、消化和免疫等指標造成負面影響，但并未對腸道菌群結構的影響進行深入研究[2]。鯉(Cyprinuscarpio)屬于雜食性魚類，是我國重要的淡水經濟養殖品種，在水產養殖中占有很大比重。據統計，2020年我國鯉養殖產量達289.67萬t，較2019年增加1.14萬t，增幅0.92%[3]。作為大宗淡水魚，鯉飼料對魚粉的需求巨大，該研究以鯉為研究對象，探究雞腸粉對鯉腸道菌群的影響，以期減少淡水魚養殖產業對魚粉的依賴，促進水產養殖行業的可持續發展。

魚類腸道內存在數量巨大的微生物菌群，菌群之間相互制約、相互平衡，構成了一個穩定的生態系統[4]。腸道菌群對于維持腸道健康、促進消化吸收、抑制病原菌、增強免疫應答及促進生長發育方面有重要作用[5]。研究表明，魚類腸道內細菌的組成和分布由營養需求所決定[6]，且菌群結構很大程度上取決于餌料成分[7]。郁二蒙等[8]使用冰鮮雜魚和人工配合飼料飼喂大口黑鱸(Micropterussalmoides)，發現投喂冰鮮雜魚的大口黑鱸與投喂人工配合飼料的大口黑鱸腸道菌群相似性較低，冰鮮雜魚組腸道菌群豐富度高于人工配合飼料組。王亞如[9]研究發現，高水平的豆粕替代魚粉會很大程度改變花鱸(Lateolabraxjaponicus)前腸腸壁優勢菌群數量組成，導致有益菌(芽孢桿菌)數量降低。殷彬[10]研究表明，當飼料中濃縮棉籽蛋白替代魚粉比例達60%時，珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×Epinepheluslanceolatu♂)前中腸菌群豐度失調，不再存在優勢菌。鐘雷等[11]研究發現，隨著飼料中脫脂蠶蛹替代魚粉比例的增加，建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)腸道菌群多樣性和益生菌屬數量均呈下降趨勢。耿彬等[12]研究發現，飼料中添加不同水平的玉米干酒糟及其可溶物能夠提高斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)腸道有益菌(鯨桿菌屬)豐度，降低有害菌(乳球菌屬)豐度。筆者基于鯉營養研究基礎，探究飼料中添加不同水平的雞腸粉對鯉腸道菌群結構的影響，分析腸道菌群的組成，以期為鯉健康養殖以及飼料中合理使用雞腸粉提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和管理試驗所用鯉幼魚購自遼寧省丹東市某養殖場，在4.3 m×1.5 m×1.2 m的水泥池中暫養14 d以熟悉試驗環境，期間投喂對照組飼料。養殖試驗在大連海洋大學遼寧省北方魚類生物學及增養殖重點實驗室循環水池(4.3 m×3.0 m×1.4 m)進行，采用網箱進行養殖。選取初始體重為(57.30 ±0.10) g 的鯉150尾隨機分為5組，每組3個重復，每個重復10尾，置于15個1.3 m×0.8 m×0.7 m的聚乙烯網箱中。養殖周期為56 d，每日投喂2次(09：00和17：00)表觀飽食，每日吸底1次、換水1 次，換水量約為 1/5。試驗水體為曝氣24 h以上的自來水，試驗期間光照為自然光照，水體溫度為(27.0±1.0)℃，溶氧為(7.0±0.5)mg/L，pH為(7.6±0.5)。

1.2 試驗飼料雞腸粉由遼寧省鞍山裕豐飼料有限公司提供，粗蛋白65.47%，粗脂肪14.80%，其他試驗飼料原料均購自于大連當地市場。試驗飼料配方見表1，以雞腸粉、魚粉、豆粕等為主要蛋白源，以豆油為主要脂肪源配制4組等氮等脂的飼料和1組負對照組(雞腸粉含量為100%)的飼料，標記為D1、D2、D3、D4、D5。添加量分別為0(D1組)、5%(D2組)、10%(D3組)、15%(D4組)、100%(D5組)。飼料原料過60目篩，混合均勻后經制粒機制成2 mm的顆粒飼料，放入42 ℃烘箱中，烘干至水分含量為10%，放入自封袋中于-20 ℃冰箱中保存。

表1 試驗飼料組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Ingredients and nutrient levels of experimental diets(dry matter basis) 單位：%

1.3 樣品采集試驗結束后，試驗魚停食 24 h，使用50 mg/L的MS-222溶液麻醉。從每個網箱中隨機取3條魚，使用無菌剪刀于冰上進行解剖，取帶有內容物的前中腸置于無菌5 mL離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于總DNA提取。

1.4 總DNA提取、PCR擴增及高通量測序取鯉的前中腸樣本按照OMEGA E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(Omega，美國)試劑盒說明書進行總DNA提取，使用Qubit?3.0 Q32866熒光計檢測DNA濃度和純度，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA質量。總DNA根據16S rRNA基因V3-V4引物：341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)；805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)在ETC811型PCR儀上進行PCR擴增。利用Illumina Miseq PE300平臺(上海生工生物技術有限公司)進行高通量測序。

1.5 數據處理采用Cutadapt、Pear、Prinseq軟件處理原始數據，原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控，使用FLASH 軟件進行拼接，利用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類。最后利用RDP對每條序列進行物種分類注釋，后續多樣性分析均在上海生工生物技術有限公司分析平臺進行。

2 結果與分析

2.1 樣本測序分析經測序，5組樣品共獲得高質量序列900 235條，其中每個樣本產生的有效序列為46 782～68 774條，平均長度為423 bp。由圖1可知，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明數據樣本夠大，測試深度足夠覆蓋樣品菌群的多樣性，測試結果合理可信。

圖1 樣本稀釋曲線Fig.1 Sample dilution curve

由圖2可知，5組鯉腸道菌群高通量測序后共獲得 890 個OTU，D1、D2、D3、D4、D5組分別包含623、491、501、502、577個OTU，5組共有的OTU數為230個，每組特有的OTU數表現為D2組(73)>D3組(67)>D1組(64)>D5組(39)>D4組(13)。D2組特有的OTU數量最多，占總OTU的8.20%。

2.2 腸道微生物 α多樣性分析由表2可知，D1組OTUs數顯著高于D3組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。每組樣本的平均OTUs數為268～382，覆蓋率均大于99%。D1組Chao指數和物種豐富度指數高于其他各組(P>0.05)。D1組Shannon指數顯著高于D4組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。D1組Simpson指數顯著低于D4組(P<0.05)，與其他組差異不顯著(P>0.05)。表明D1組鯉腸道菌群豐富度和均勻度顯著高于D4組(P<0.05)，D1組鯉腸道菌群相對豐度更高，鯉腸道菌群豐富度隨雞腸粉添加量的增加呈先下降后上升的趨勢。

圖2 飼料中添加雞腸粉對鯉腸道菌群組成影響的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the effect of chicken intestinal meal addition to feed on the composition of the intestinal flora of Cyprinus carpio

表2 鯉腸道菌群α多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of the intestinal flora of Cyprinus carpio

2.3 腸道菌群結構的組成各組鯉腸道菌群在門水平相對豐度見圖3。在門水平上，各組優勢菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，其中變形菌門在各組中占絕對優勢，相對豐度分別為(63.27±7.33)%、(71.51±4.12)%、(53.72±8.84)%、(65.77±2.79)%、(68.92±8.94)%。D1、D2組第二優勢菌群為擬桿菌門，相對豐度分別為(16.25±2.60)%、(15.88±1.52)%；D3、D4組第二優勢菌群為梭桿菌門，相對豐度分別為(31.00±15.41)%、(21.97±9.93)%；D5組第二優勢菌群為梭桿菌門，相對豐度為(12.61±8.56)%，與第三優勢種群擬桿菌門的相對豐度(12.45±3.09)%相近。

各組鯉腸道菌群在屬水平的相對豐度見圖4。在屬水平上，各組優勢菌群均為鄰單孢菌屬(Pleomorphomonas)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、寡養單孢菌屬(Stenotrophomonas)、氣單孢菌屬(Aeromonas)、戴爾福特菌屬(Delftia)。D1組第一優勢菌群為鄰單孢菌屬，相對豐度為(18.79±3.57)%，優勢菌群的相對豐度表現為鄰單孢菌屬>不動桿菌屬>鞘氨醇桿菌屬>寡養單孢菌屬>戴爾福特菌屬>鯨桿菌屬>氣單孢菌屬。D2組第一優勢菌群為不動桿菌屬，相對豐度為(22.36±3.31)%，優勢菌群表現為不動桿菌屬>鞘氨醇桿菌屬>鄰單孢菌屬 >戴爾福特菌屬>寡養單孢菌屬>鯨桿菌屬>氣單孢菌屬。D3組第一優勢菌群為鯨桿菌屬，相對豐度為(31.00±15.41)%，優勢菌群的相對豐度表現為鯨桿菌屬>鄰單孢菌屬>不動桿菌屬 >氣單孢菌屬>鞘氨醇桿菌屬>寡養單孢菌屬>戴爾福特菌屬。D4組第一優勢菌群為鄰單孢菌屬，相對豐度為(36.18±14.20)%，優勢菌群的相對豐度表現為鄰單孢菌屬>鯨桿菌屬>不動桿菌屬 >鞘氨醇桿菌屬>氣單孢菌屬>寡養單孢菌屬>戴爾福特菌屬。D5組絕對優勢菌群為鄰單孢菌屬，相對豐度為(19.53±8.99)%，優勢菌群表現為鄰單孢菌屬>不動桿菌屬> 鯨桿菌屬>鞘氨醇桿菌屬>氣單孢菌屬>寡養單孢菌屬>戴爾福特菌屬。

圖3 鯉腸道菌群在門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of intestinal flora of Cyprinus carpio at phylum level

2.4 腸道微生物 β多樣性分析β多樣性分析主要用于比較樣本之間菌群結構是否相似。非度量多維度分析(NMDS)是一種常用的β多樣性分析方法。圖形中的點代表樣本，點與點之間的距離可以反映出樣本差異程度，距離越近相似度越高。同一圓圈內的點代表樣本之間無明顯差異，沒有交匯圓圈內的點代表樣本之間有明顯差異。由圖5可知，D1組與D2、D3、D4組沒有交集，D3組與D4組兩者之間也沒有交集，說明D1組與D2、D3、D4組，D3組和D4組腸道微生物的組成有明顯差異，表明飼料中添加不同水平的雞腸粉后，鯉腸道微生物組成有明顯差異。D1組與D5組兩者之間有交集，表明當飼料中雞腸粉添加量為100%時，鯉腸道微生物組成與添加量為0時無明顯差異。

圖5 鯉腸道菌群的β多樣性分析Fig.5 β-diversity analysis of intestinal flora of Cyprinus carpio

2.5 腸道菌群結構差異分析使用LEfSe分析鯉腸道樣本具有顯著豐度差異特征的菌群，D1組和D2組在屬水平菌群差異見圖6和圖7。 由在屬水平上LEfSe分析的結果可知，D1組顯著豐度差異特征菌為紫單孢菌屬(Porphyromonas)，D2組為螺旋體屬(Brevinema)。圖7中，在綱(Class)至屬水平上，D1組和D2組菌群豐度差異顯著，D1組主要富集擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、紫單孢菌科(Porphyromonadaceae)、紫單孢菌屬(Porphyromonos)；D2組主要富集螺旋體綱(Spirochaetia)、螺旋體目(Spirochaetales)、螺旋體科(Brevinemataceae)、螺旋體屬(Brevinema)。

圖6 LEfSe多級物種層級樹Fig.6 LEfSe multi-level species hierarchy tree diagram

圖7 LDA判別柱形圖Fig.7 LDA discriminant bar chart

3 討論

健康的魚類腸道中定殖大量的微生物，菌群之間相互平衡形成了穩定的生態系統，維持著機體內環境的穩定。正常的菌群在維持腸道健康、促進營養物質的消化吸收、抑制病原菌侵入、機體免疫及魚體生長發育過程中起著重要作用[14-15]。因此研究魚類腸道菌群的變化對于魚類的健康養殖有重要意義。α多樣性可以反映腸道菌群的豐富度和均勻度，Chao指數、Ace指數、Shannon 指數越大，Simpson 指數越小，說明腸道菌群的物種多樣性和均勻度越高[16-17]。β多樣性分析主要用于比較樣本之間菌群結構是否相似，在該試驗中使用非度量多維度分析比較各組鯉腸道菌群的相似性，發現D1組與D2、D3、D4組，D3組和D4組腸道微生物的組成差異顯著(P<0.05)，表明飼料中添加雞腸粉對鯉腸道微生物組成有顯著影響。在該研究中，D1組Shannon 指數顯著高于D4組，D1組Simpson 指數顯著低于D4組，說明D1組鯉腸道菌群豐富度和均勻度顯著高于D4組。D1組OTU數顯著高于D3組，與其他組差異不顯著，表明D1組腸道菌群的相對豐度顯著高于D3組。表明飼料中添加10%和15%的雞腸粉能夠降低鯉腸道微生物多樣性，結合門水平和屬水平分析結果，鯉腸道微生物多樣性的降低很有可能是由于添加10%和15%的雞腸粉促進了有益菌群的繁殖，抑制條件致病菌的滋生，從而降低了D3、D4組腸道菌群的多樣性。研究發現魚類腸道微生物多樣性會受到飼料成分的影響[18-19]，鐘雷等[11]研究表明，飼料中脫脂蠶蛹添加量的增加會導致建鯉腸道菌群多樣性和益生菌屬數量下降。Yang等[20]發現投喂不同日糧的鯉腸道菌群的多樣性和豐度差異顯著，投喂浮萍組的鯉腸道擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著高于投喂蚯蚓組。Zarkasi等[21]研究表明，飼料成分對大西洋鮭魚(SalmosalarL.)腸道微生物多樣性影響顯著，腸道菌群多樣性的改變也與飲食代謝相關。

研究表明，鯉腸道菌群主要由變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門構成，這些細菌在魚類營養和機體健康方面有重要作用[22]。在該研究中，飼喂不同添加水平雞腸粉的各組鯉腸道主要菌群在門水平上主要由變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門構成，這與一些對鯉腸道微生物群落研究結果相一致[23-24]，但各組優勢菌群的相對豐度有所差異。變形菌門是水產動物腸道菌群的優勢種群之一，但相對豐度過高可能存在水產動物潛在的致病風險[25]。在該研究中，各組鯉腸道變形菌門的相對豐度均無顯著差異，但D3組變形菌門的相對豐度低于其他各組，表明飼料中添加10%的雞腸粉能夠在一定程度上降低鯉養殖過程中的致病風險。研究發現，大多數益生菌來自擬桿菌門和厚壁菌門，且擬桿菌和厚壁菌也被證實能夠改善魚類消化和免疫狀態[26-27]。梭桿菌門被證實可以分泌丁酸鹽和合成維生素，改善魚類健康[28]。在該試驗中，D1組擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度均高于其他各組，分別為(16.25±2.60)%和(7.73±4.20)%，D4組擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度均低于其他各組，分別為(7.46±6.38)%和(1.17±0.25)%。但D3組和D4組梭桿菌門相對豐度分別為(31.00±15.41)%和(21.97±9.93)%，D1組梭桿菌門相對豐度僅為(6.35±3.37)%，相較于D1組，D3、D4組梭桿菌門的相對豐度有很大幅度升高。以上結果很可能是由于飼料中添加10%和15%的雞腸粉后，促進了鯉腸道有益菌繁殖，改變了有益菌群的相對豐度。

使用LEfSe分析鯉腸道樣本具有顯著豐度差異特征的菌群，結果發現，D1組顯著豐度差異特征菌為紫單孢菌屬，D2組為螺旋體屬，說明飼料中添加5%的雞腸粉影響了鯉腸道菌群結構。在屬水平上，鯉腸道菌群主要由鄰單孢菌屬、鯨桿菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇菌屬、寡養單孢菌屬、氣單孢菌屬、戴爾福特菌屬構成。研究表明，鄰單孢菌屬包含許多條件致病菌，能夠引起魚類腹瀉[24，29]。各組間鄰單孢菌屬相對豐度差異不顯著，但D2、D3組鄰單孢菌屬相對豐度較D1組有所降低，說明飼料中添加10%和15%的雞腸粉能夠在一定程度上降低條件致病菌屬的相對豐度，降低患病的可能。值得注意的是，D4組鄰單孢菌屬相對豐度為(36.18±14.20)%，是D1組相對豐度(18.79±3.57)%的1.93倍，條件致病菌豐度有較大幅度的升高。與此同時，D4組鯨桿菌屬相對豐度也有較大幅度增加，由D1組的(6.34±3.37)%上升為(21.97±9.93)%，表明飼料中添加15%的雞腸粉能夠提升有益菌屬的相對豐度對致病菌屬起到拮抗作用。D5組鄰單孢桿菌的相對豐度與D1組較為接近，但D5組鯨桿菌屬相對豐度為(12.61±8.56)%，是D1組的1.99倍，表明飼料中添加100%的雞腸粉能夠提高有益菌群的相對豐度。研究表明，鯨桿菌屬在鯉腸道中屬優勢菌屬，能夠發酵多肽碳水化合物和產生維生素B12參與魚類的營養消化過程，也能夠在一定程度上抑制病原菌的繁殖和增強機體的免疫狀態[30]。氣單孢菌在正常情況下是健康魚類腸道中的有益菌，能夠抑制病原菌在腸道中的繁殖，提高機體免疫力[31-32]。不動桿菌屬被認為是有益菌，能夠分泌胞外酶促進魚類的消化和吸收[33]。鞘氨醇菌屬于強過氧化氫菌，具有很強的解毒能力[21]。在該研究中，D3、D4、D5組鯨桿菌屬的相對豐度和D2、D3、D4、D5組氣單孢菌屬的相對豐度較D1組都有較大幅度增加，說明飼料中添加適量的雞腸粉能夠在一定程度上提高有益菌的相對豐度。D3、D4組不動桿菌屬和鞘氨醇菌屬相對豐度的減少很可能是與致病菌屬拮抗作用的結果。

4 結論

在該研究中，飼料中添加適量的雞腸粉會降低鯉腸道菌群的多樣性，但具有改善腸道菌群結構的效果。相較于雞腸粉添加量為0%、5%、15%和100%，添加量為10%時，鯉腸道致病菌豐度最低，有益菌相對豐度最高，且當雞腸粉添加量為100%，鯉腸道有益菌相對豐度也未下降。因此，在該試驗條件下，飼料中添加10%的雞腸粉對鯉腸道菌群結構有較好的改善作用。