山羊ESR1·TENM1和THEM4多態性及其與繁殖性狀相關性研究

李昆諭，劉玉芳，陶 林，江炎庭，歐陽依娜，儲明星*，

(1.云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明 650224；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所/農業農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

產羔性狀對于山羊的生產尤其重要，而提高單胎產羔數是提高產羔性狀最主要的途徑。山羊產羔數是一個極其復雜的性狀，且產羔性狀遺傳力較低(約為0.1)，因此如何快速提高山羊產羔數是養羊業一個亟待解決的難題。與傳統育種手段相比，分子遺傳育種具有準確度高、可操作性強、育種成本低等優點，能更加高效、快速地對山羊產羔性狀進行改良。利用分子標記技術有利于高繁殖力山羊的篩選，從而加快育種進程，可為山羊的選育工作提供更多便利[1]。ESR1(estrogen receptor 1)基因定位于9號染色體，擁有12個外顯子。雌激素受體α由ESR1編碼，通過與靶基因上的特異性效應元件結合，從而調節靶基因的表達[2]。雌激素受體α為雌激素的受體，與雌激素結合后，對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發育都發揮著重要作用[3]。研究表明，ESR基因是調控豬高產仔數的主效基因之一[4]。Tao等[5]通過GWAS、ROH 分析和選擇特征檢測發現ESR1是參與山羊卵巢功能的一個重要候選基因。TENM1和THEM4基因分別定位于山羊X號和3號染色體，分別擁有35個和6個外顯子。Lai等[6]通過對奶山羊進行全基因組測序發現THEM4 在高繁殖力組中被特異性選擇，TENM1 在低繁殖力組中被特異性選擇。TENM1 屬于Tenm/Odz基因家族。研究表明，Ten-M參與胚胎早期發育的調節，并在神經系統發育后期發揮作用[7-8]。

該研究所用候選基因來自實驗室前期重測序數據，通過GWAS分析(顯著性閾值為0.05)所得的在云上黑山羊(云上黑山羊是以云嶺山羊為母本、努比山羊為父本培育而成的我國第一個肉用黑山羊品種[9-10])全基因組中的正選擇基因(positively selected genes,PSG)。結合文獻資料推測ESR1、TENM1和THEM4 可能對山羊繁殖性狀有一定的影響，在前期數據中篩選出與產羔數相關的7個SNPs位點，其中ESR1為g.76097125C>T和g.76139051A>G位點，TENM1為g.17236451G>C、g.17333655C>T、g.17372494A>G和g.17586866T>C，THEM4為g.101275605G>A位點。采用 MassARRAY?SNP分型技術，在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊群體中對候選基因的基因型進行檢測。MassARRAY?SNP分型技術是Agena公司推出的一個基因分析工具，通過引物延伸或切割反應與靈敏、可靠的MALDITOF 質譜技術相結合，實現基因分型檢測，實驗設計非常靈活，分型結果準確性高[11]。分型后分析其多態性與山羊繁殖性狀的相關性，以期為山羊的高繁殖力分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品試驗用山羊飼養條件和生長環境一致，年齡2～5歲，共采集768只山羊(云上黑山羊544只、濟寧青山羊133只、遼寧絨山羊91只)的血液。該試驗將濟寧青山羊視為高繁殖力群體，將遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[9-10]。云上黑山羊有至少1胎產羔記錄，部分有初生窩重和斷奶窩重(3月齡)記錄。所有山羊均采用頸靜脈采血(10 mL/只)，使用EDTA-K2抗凝，-20 ℃下保存。試驗山羊品種及其采樣信息見表1。

表1 試驗山羊品種及其采樣信息Table 1 The breeds of test goats and their sampling information

1.2 血液DNA的提取使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.3 基因分型采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術對ESR1、TENM1和THEM4基因突變位點進行檢測，相關引物信息見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of the primers

1.4 數據統計與分析使用Microsoft Excel 2021軟件統計山羊ESR1、TENM1和THEM4 突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量(PIC)、雜合度(He)和有效等位基因數(Ne)，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。使用SPSS 25軟件進行單因素方差分析，采用Tukey法進行多重比較，對山羊基因型與產羔表型數據進行相關性分析。試驗數據均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1ESR1 多態性分析利用Sequenom MassARRAY?SNP對768只山羊血液DNA進行基因分型。結果顯示，ESR1 g.76097125C>T和g.76139051A>G位點在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中存在多態性，其中g.76097125C>T位點基因型為CC、CT、TT型，g.76139051A>G位點基因型為AA、AG、GG型(圖1)。

圖1 ESR1 位點分型結果Fig.1 The locus typing results of ESR1 gene

統計濟寧青山羊(高繁)和遼寧絨山羊(低繁)中ESR1 2個位點的基因型頻率和基因頻率，結果見表3～4。ESR1 g.76097125C>T位點的基因型頻率和基因頻率在高繁山羊和低繁山羊群體之間差異極顯著(P<0.01)。g.76097125C>T位點在高繁群體和低繁群體的優勢基因型為CC，優勢等位基因為C；g.76139051A>G位點的基因型頻率和基因頻率在高繁山羊和低繁山羊群體之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態位點在高繁、低繁山羊品種中的基因型頻率

表4 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態位點在高繁、低繁山羊品種中的基因頻率

群體遺傳學統計表明，ESR1 g.76097125C>T位點在濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(PIC<0.25)，在云上黑山羊中為中度多態(0.25G在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為中度多態(0.25T位點在濟寧青山羊中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(P<0.05)，在遼寧絨山羊和云上黑山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)；g.76139051A>G在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)(表5)。

2.2TENM1基因多態性分析基因分型結果表明，TENM1 4個候選SNPs位點在3個群體中均存在多態性(圖2)。如表3～4所示，TENM1 g.17372494A>G、g.17586866T>C位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體之間差異顯著(P<0.05)，但TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 TENM1 位點分型結果Fig.2 The locus typing results of TENM1 gene

群體遺傳學統計表明，TENM1 g.17333655C>T位點在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(PIC<0.25)，TENM1基因其余位點多態性為0.01～0.36。卡方檢驗結果表明，TENM1 g.17236451 G>C和g.17586866 T>C位點在云上黑山羊和遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)(表5)。

2.3THEM4 多態性分析基因分型結果表明，THEM4 g.101275605 G>A位點在3個群體中均存在多態性(圖3)。如表3～4所示，THEM4 g.101275605 G>A位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體之間差異均達到顯著水平(P<0.05)，g.101275605 G>A位點在3個群體中只有GG和GA 2個基因型，其中GG為優勢基因型，G為優勢基因。

群體遺傳學統計分析表明，THEM4 g.101275605 G>A位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為低度多態(PIC<0.25)。卡方檢驗結果表明，THEM4 g.101275605 G>A在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)(表5)。

圖3 THEM4 位點分型結果Fig.3 The locus typing results of THEM4 gene

2.4 候選SNPs位點與云上黑山羊繁殖性狀的相關性分析由表6可知，ESR1 g.76097125C>T位點CT和TT型山羊的初生窩重顯著高于CC型(P<0.05)；TENM1 g.17236451G>C位點GC型山羊的產羔數和斷奶窩重顯著高于GG型(P<0.05)；TENM1 g.17333655C>T位點CC型山羊的產羔數顯著高于CT型(P<0.05)。其余SNPs位點多態性與云上黑山羊產羔數、初生窩重和斷奶窩重之間無顯著相關(P>0.05)。

表5 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態位點在不同山羊品種中的群體遺傳學分析Table 5 The population genetic analysis of 7 polymorphic sites of ESR1,TENM1 and THEM4 genes in different goat breeds

表6 ESR1、TENM1和THEM4 基因對云上黑山羊產羔性能的影響Table 6 Effects of ESR1,TENM1 and THEM4 genes on the lambing performance of Yunshang Black Goat

3 討論

ESR1 編碼的雌激素受體1與雌激素結合后，在雌性繁殖周期中卵泡的生長發育發揮著重要的作用。研究表明，ESR基因與小尾寒羊和湖羊的多羔性狀密切相關[12-14]。劉欣[15]研究發現卵泡期成年母牛ESR1 在卵巢中表達量最高、在子宮中表達量最低。白淑等[16]使用免疫組織和熒光定量技術檢測濟寧青山羊出生后發育過程中雌激素受體在子宮的定位及表達，發現ESR1在子宮腔上皮、腺上皮、基質、血管內皮和平滑肌細胞胞核中均有表達，證實了ESR1參與調節子宮內膜與肌層的增殖和分化。將雌性小鼠的ESR基因敲除后，ESR缺陷雌性小鼠出現促黃體生成素調節紊亂、卵巢不排卵等現象，進而影響了小鼠的生育能力[17]。將ESR1 過表達可能導致卵泡閉鎖[18]。總體來看，ESR1 可能對山羊的繁殖有一定的影響。該研究結果發現云上黑山羊群體中ESR1 g.76097125C>T位點TT型和CT型山羊的初生窩重高于CC型，因此推測該位點C>T突變可能對于云上黑山羊群體而言是一個優良的突變，可能會導致羔羊初生窩重增加。TENM1屬于Tenm/Odz基因跨膜蛋白家族，目前關于TENM1 對山羊繁殖的影響研究較少。研究表明，TENM1 的缺失可能影響生殖系統的發育，在線蟲中TENM1被證實是早期胚胎發生、生殖細胞發育、性腺遷移和表皮形態發生所必需的[19-20]。該研究結果表明，TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位點的多態性與云上黑山羊的產羔數顯著相關，其中g.17236451G>C位點GC型山羊的產羔數比GG型高0.131，G>C的突變為有利于產羔的突變；g.17333655C>T位點CC型山羊產羔數比CT型高0.190，C>T的突變導致產羔數的下降，為不利的突變。綜上所述，TENM1基因g.17236451G>C和g.17333655C>T位點可作為云上黑山羊產羔數選擇的潛在分子標記。

4 結論

該研究結果表明，TENM1基因g.17236451G>C和g.17333655C>T位點與云上黑山羊產羔數存在顯著相關，可作為云上黑山羊產羔數選擇的潛在分子標記。ESR1基因g.76097125C>T位點與云上黑山羊初生窩重存在顯著相關，可作為云上黑山羊初生窩重選擇的潛在分子標記。