氟西汀調節TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路改善CUMS大鼠抑郁樣行為

呂霞，黃麗，張美琳，樊珺婷，馬澤微，劉歡

抑郁癥是一種以情緒低落、興趣減退和快感喪失為主要癥狀的精神類疾病，目前全球抑郁癥的患病率約為4.3%［1］，中國人的終生患病率約為3.3%［2］，已成為非正常死亡和致殘的主要原因之一。抑郁癥發病機制復雜，近年來研究表明神經炎癥與抑郁癥密切相關［3］，其中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體是固有免疫的重要組成因子，介導多種動物模型外周和中樞炎癥反應及抑郁樣行為表現［4-5］。Toll樣受體4（TLR4）與炎癥體信號通路存在復雜的關聯［6］，而核因子κB（NF-κB）傳遞信號對NLRP3的激活是必需的［7］。氟西汀（fluoxetine）是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs），主要通過抑制中樞神經系統突觸前釋放的5-羥色胺再攝取，增加腦內5-羥色胺供給，從而有效控制抑郁癥狀。研究發現，氟西汀在神經系統疾病中具有抗炎潛力，可抑制促炎因子的水平［8］。但氟西汀能否通過調控TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路而改善抑郁大鼠的抑郁樣行為尚鮮見相關報道。本研究采用慢性不可預知性輕度應激（CUMS）構建大鼠抑郁癥模型，在明確氟西汀改善CUMS大鼠抑郁樣行為的基礎上，進一步探究其對TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠18只，6~7周齡，平均體質量（180±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司［動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010］。于北京靈賦生物科技有限公司實驗動物中心SPF級環境內飼養，溫度（22±2）℃，相對濕度60%±5%，光照/黑暗12 h交替。

1.2 實驗試劑及主要儀器 氟西汀購自上海吉至生化科技有限公司；白細胞介素（IL）-1β和IL-18酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和山羊抗兔二抗購于山東思科捷生物技術有限公司；山羊抗兔NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、TLR4、NF-κB、胱 天 蛋 白 酶1（Caspase-1）和 活 化 的Caspase-1（cleaved Caspase-1）抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；山羊抗兔熒光二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。ChemiDocTM XRS成像系統、多功能酶標儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組、給藥及CUMS模型的建立 適應性喂養1周后，將大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組和氟西汀組，每組6只。模型組和氟西汀組參照文獻［9］進行CUMS造模。刺激方式包括：禁食12 h，禁水12 h，晝夜顛倒，墊料潮濕8 h，60 Hz噪聲刺激1 h，夾尾2 min，搖晃鼠籠15 min，4℃冰水游泳5~10 min，束縛2 h。每天從9種刺激方式中隨機選擇2種，3 d內不重復，持續刺激11周。CUMS干預第7周開始，氟西汀組灌胃氟西汀（10 mg·kg-1·d-1），其余組灌胃1 mL生理鹽水，連續給藥5周。給藥5周后，進行行為學檢測。行為學檢測結束后所有大鼠禁食過夜，采用吸入CO2安樂死處理，斷頭后取出完整腦組織，右側腦組織經液氮快速冷凍后保存于-80℃冰箱備用，左側腦組織于4%多聚甲醛固定并進行石蠟包埋。

1.3.2 曠場實驗觀察大鼠抑郁樣行為 在第11周CUMS干預結束后進行曠場實驗，將每只大鼠單獨放置在曠場實驗箱（100 cm×100 cm×40 cm）的底部中心區域，實驗箱底部分成16個相等的正方形。經過30 s的適應后，使用自動視頻跟蹤系統記錄5 min內動物的水平運動距離及垂直站立次數。每次實驗后，用乙醇清潔設備。

1.3.3 高架十字迷宮實驗觀察大鼠抑郁樣行為 高架十字迷宮實驗設備是由2個開臂（50 cm×10 cm）、2個閉臂（50 cm×10 cm×40 cm）和1個中心平臺（10 cm×10 cm）組成一個十字形結構。在每次測試前，將大鼠單獨放在中心平臺上，面向同一個閉臂，并允許其自由探索迷宮5 min。采用自動視頻跟蹤系統記錄其水平運動距離及停留在閉臂的時間。每次實驗后，用乙醇清潔設備。

1.3.4 ELISA檢測腦組織IL-1β和IL-18的含量 取適量腦組織，按質量體積比1︰9加入PBS，使用手持勻漿儀于冰上研磨后，低溫14 000 r/min離心15 min，取上清液。先使用BCA試劑盒定量上清液中的總蛋白，然后嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行標準品的稀釋，加樣，并依次完成溫育、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止反應等過程后，使用酶標儀在450 nm波長處依序測量各組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β和IL-18的光密度（OD）值，最終根據稀釋倍數及BCA蛋白定量計算腦組織中炎性因子IL-1β和IL-18的含量。

1.3.5 免疫熒光染色觀察海馬CA3區及皮質區NLRP3、ASC和Caspase-1的表達 石蠟包埋的左側腦組織切片（4μm），于60℃恒溫箱烤片15 min后進行免疫熒光染色。依次進行脫蠟、水化、封閉、抗原修復、封閉、抗體孵育等過程，使用抗熒光淬滅劑封片，并用倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.3.6 Western blot檢測各組大鼠腦組織TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路相關蛋白的表達 右側腦組織于冰上解凍后加入適量組織裂解液，充分研磨后離心取上清液為蛋白質樣品，BCA法計算蛋白質濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，各組等蛋白質量上樣、電泳和轉膜，3%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗稀釋液（1︰10 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗稀釋液，于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次。顯影劑顯色，凝膠成像系統進行蛋白條帶的曝光和成像。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0進行數據分析，采用均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氟西汀對CUMS大鼠行為學的影響 與對照組相比，模型組大鼠在曠場的運動距離及站立次數均顯著減少（P＜0.05），在高架十字迷宮的運動距離減少，且在閉臂的停留時間增加（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組大鼠在曠場的運動距離及站立次數均明顯增多（P＜0.05），在高架十字迷宮中的運動距離增加，且在閉臂的停留時間減少（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各組大鼠抑郁樣行為變化（n=6，）

Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各組大鼠抑郁樣行為變化（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組氟西汀組F曠場實驗總運動距離（m）12.14±3.89 3.75±2.25a 10.66±2.12b 14.555＊＊站立次數10.67±4.84 3.17±3.12a 10.67±3.39b 7.550＊＊高架十字迷宮實驗總運動距離（m）8.24±1.79 2.21±1.18a 7.96±1.62b 28.763＊＊閉臂停留時間（s）237.98±7.32 284.32±7.99a 208.38±27.41b 30.342＊＊

2.2 氟西汀對CUMS大鼠腦組織IL-1β和IL-18含量的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦組織IL-1β和IL-18的含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組大鼠腦組織IL-1β和IL-18的含量顯著降低（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of IL-1βand IL-18 in brain tissue of CUMS rats between the three groups圖1 各組CUMS大鼠腦組織IL-1β和IL-18含量比較

2.3 氟西汀對CUMS大鼠腦組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達的影響 免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠海馬CA3區和皮質區NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達明顯降低（P＜0.05），見圖2、3。

2.4 氟西汀對CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路的影響 與對照組比較，模型組大鼠TLR4、NF-κB、NLRP3、cleaved Caspase-1和Caspase-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組大鼠上述蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖4、表2。

3 討論

3.1 氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁樣行為 CUMS刺激符合抑郁癥誘發因素（長期、慢性、低強度的壓力刺激）的特征，能夠高效度地模擬人類應激狀態時的情緒，誘導嚙齒類動物產生焦慮、抑郁樣行為［10］，具有良好的表觀效度、構造效度和預測效度［11］，是抑郁癥有效且使用最廣的制備模型［12］。本研究采用CUMS刺激建立抑郁癥模型后發現，模型組大鼠在曠場實驗和高架十字迷宮實驗中表現出自主活動能力和探索能力的降低，表明抑郁癥模型制備成功。而氟西汀治療能夠顯著改善CUMS所致的大鼠運動能力降低及探索行為的減少，表明氟西汀具有改善CUMS大鼠抑郁樣行為的作用，與以往的研究結果一致［13］。

Fig.2 Expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 proteins in hippocampal CA3 area and cortex of rats in each group(immunofluorescence staining, ×200)圖2 各組大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白在海馬CA3區及皮質區的表達（免疫熒光染色，×200）

Fig.3 Comparison of relative expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 in brain tissue of rats between the three groups圖3 各組大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對表達水平的比較

Fig.4 Effects of fluoxetine on TLR4/NF-κB/NLRP3 inflammasome signal pathway of CUMS rats圖4 氟西汀對CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路的影響

Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各組大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表達水平比較（n=6

Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各組大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表達水平比較（n=6

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組氟西汀組F Caspase-1 1.00±0.00 1.42±0.14a 1.07±0.17b 34.212＊＊TLR4 1.00±0.00 1.42±0.27a 1.12±0.21b 16.689＊＊NF-κB 1.00±0.00 1.44±0.33a 0.97±0.19b 16.095＊＊cleaved Caspase-1 1.00±0.00 1.36±0.14a 1.06±0.17b 28.289＊＊NLRP3 1.00±0.00 1.28±0.28a 0.97±0.25b 16.172＊＊

3.2 氟西汀可以抑制CUMS大鼠腦內NLRP3炎癥小體的激活 炎癥因子在抑郁癥的發生發展中發揮著重要的作用，在抑郁動物模型［14］和臨床研究［15］中均發現IL-1β和IL-18等炎癥因子的表達顯著升高。本研究發現，慢性應激可以顯著增加大鼠腦組織中IL-1β和IL-18的含量，而氟西汀治療可以顯著降低CUMS大鼠腦組織中IL-1β和IL-18的含量，從而減輕抑郁樣行為，進一步說明了降低促炎細胞因子的水平是改善CUMS大鼠抑郁樣行為的關鍵。炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌與NLRP3炎癥小體的激活相關。NLRP3炎癥小體是一種調節先天性免疫炎癥反應的關鍵蛋白質復合物，包括NLRP3、ASC和效應蛋白Caspase-1［16］，是目前研究最廣泛的炎癥小體。NLRP3炎癥小體可被應激和細胞因子等刺激激活，誘導IL-1β和IL-18成熟并釋放到胞外，從而誘發神經炎癥。研究表明NLRP3炎癥小體參與了抑郁和焦慮的發病機制［17］；而且NLRP3基因敲除（NLRP3-/-）能改善小鼠因慢性應激引起的抑郁樣行為［14］，可見其是連接慢性應激與抑郁狀態之間的關鍵介質。本研究顯示，氟西汀治療可以逆轉CUMS刺激引起的腦組織NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達上調，并降低腦組織內IL-1β和IL-18的含量，表明氟西汀可抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少IL-1β和IL-18的成熟和釋放，進而改善CUMS大鼠的抑郁樣行為。

3.3 氟西汀抑制NLRP3炎癥小體的激活與TLR4/NF-κB信號有關 NLRP3炎癥小體被激活誘導炎癥反應前需要接受啟動信號，如TLR4/NF-κB信號的激活，活化的NF-κB進一步上調NLRP3、pro-IL-1β的mRNA轉錄水平，激活炎癥小體，活化的炎癥小體誘導IL-1β和IL-18的成熟與釋放并啟動下游炎癥反應。在抑郁癥小鼠模型中發現，作為啟動信號的TLR4與NLRP3呈現一致的高表達［15］；而且NF-κB信號與NLRP3炎癥小體共同調節IL-1β的轉錄和功能［18］；慢性應激可以顯著增加海馬中TLR4和NF-κB的表達，加重嚙齒類動物的抑郁樣行為，而敲除TLR4基因可以降低TLR4和NF-κB的表達，改善CUMS所致的抑郁樣行為［19］。以上研究表明TLR4/NF-κB信號是誘導NLRP3炎癥小體的激活及啟動下游炎癥反應的關鍵介質，可能作為抑郁癥治療的新靶點。本研究結果表明CUMS刺激后，TLR4/NFκB信號和NLRP3呈現一致的高表達，而氟西汀治療又可逆轉這種高表達，提示氟西汀可能通過TLR4/NF-κB信號調控NLRP3炎癥小體的激活，影響其介導的炎癥反應，從而發揮對CUMS大鼠抑郁樣行為的保護作用。

綜上所述，本研究進一步驗證了氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路的激活，進而減少腦組織中促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放，減輕CUMS所致的炎癥反應有關。氟西汀作為一種傳統的抗抑郁藥物，不僅可以通過選擇性抑制5-羥色胺的再攝取治療抑郁癥患者，而且可以通過調控TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號通路改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，為臨床治療抑郁癥提供了新的思路和實驗依據。