電針調控Nrf2/HO-1通路對缺血缺氧性腦損傷大鼠小膠質細胞活化的影響

張赟，李珂，補王珍

缺血缺氧性腦損傷（hypoxia-ischemia brain damage，HIBD）是新生兒殘疾和死亡的主要原因之一，可造成癲癇、智力低下、腦癱、視覺運動或感知功能障礙等［1］。因此，迫切需要探索更好的治療措施以最大程度地減少新生兒腦部損傷。小膠質細胞在大腦缺血時會立即被激活，促進神經炎癥的發生［2］。小膠質細胞能夠極化為經典（M1）和替代（M2）表型，M1型可釋放白細胞介素（IL）-1β等促炎因子并加劇腦損傷，而M2型小膠質細胞可釋放IL-10等抗炎因子和轉化生長因子β（TGF-β）等生長因子，保護神經［3］。因此，有效抑制小膠質細胞的過度活化并在一定程度上促進其由M1型向M2型轉換可能對治療新生兒HIBD具有重要作用［3］。針灸可改善腦損傷，而電針是電刺激與傳統針灸的結合，能夠有效抑制腦損傷大鼠小膠質細胞由M1型向M2型轉換，起到神經保護作用［4］。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是重要的抗氧化信號通路，激活該通路可有效改善HIBD大鼠腦損傷［5］。另外，激活Nrf2/HO-1通路還能抑制腦缺血再灌注小鼠小膠質細胞的激活，從而降低炎癥反應［6］。目前，鮮見有關電針對HIBD中小膠質細胞活化以及Nrf2/HO-1通路的影響研究。本研究旨在通過探究電針調控Nrf2/HO-1通路對HIBD大鼠小膠質細胞活化的影響，為HIBD治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級7日齡SD大鼠40只，體質量10~12 g，購自揚州大學，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，于通風良好且室溫（24±3）℃的環境中飼養7 d（光照12 h/d）。針灸針（河南澤垣醫療器械銷售有限公司，貨號：HT0067）；BCA試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司，貨號：YRX301804R）；Nrf2抑制劑全反式維甲酸（南京北魚生物科技有限公司，貨號：BYDR-C17608000）；兔抗離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA1）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、β-actin、HO-1、Nrf2抗體、HRP-IgG抗體（貨號：ab5076、ab15323、ab8227、ab13243、ab62352、ab6721）購自英國Abcam公司；兔抗精氨酸酶（Arginase）抗體（貨號：93668）購自Cell Signaling Technology公司；兔抗CD68抗體（上海恒斐生物公司，貨號：bs-0649R-2）；IL-10、IL-1β試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E04595r、CSB-E08055r）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（翌圣生物，貨號：50101ES01）；丙二醛（MDA）試劑盒（武漢益普生物公司，貨號：YX-E20805）；凝膠成像儀（上海百賽生物技術股份有限公司）；酶標儀（上海研卉生物科技有限公司）。

1.2 分組與HIBD模型構建 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組［7］，10只/組。除假手術組外其余組大鼠均進行HIBD模型建立：乙醚麻醉大鼠后將其固定并暴露頸部，于頸部切開0.5 cm長切口，分離皮膚并暴露左側頸總動脈及迷走神經，剝離迷走神經，對頸總動脈進行結扎后縫合，將大鼠放回母鼠籠中1 h后將其放入含8%氧氣+92%氮氣的密閉缺氧箱中2 h即造模結束，繼續母鼠喂養［8］。造模結束后，Longa評分為2～3分即為造模成功［9］。假手術組大鼠僅暴露左側頸總動脈及迷走神經，不進行結扎及缺氧處理；造模結束次日取電針組、電針+全反式維甲酸組大鼠，用無菌針灸針在百會穴向前平刺2 mm，連接電極一端，于右耳根部連接電極另一端形成回路，接G6805電極儀（疏密波、電流1 mA、頻率1～20 Hz），右耳微顫則為針刺有效（30 min/次，1次/d）［10］；電針處理后，電針+全反式維甲酸組大鼠腹腔注射7 mg/kg全反式維甲酸，共3 d（1次/d），其余組大鼠注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠神經行為學評分 在造模結束及實驗結束后均通過Longa評分進行神經行為學評估：未出現神經功能缺損體征（0分）；對側前爪不能伸展（1分）；偏癱并于偏癱側轉圈（2分）；于行走時向偏癱一側跌倒（3分）；無法行走、意識昏迷（4分）［9］。1.4 大鼠行為學觀察

1.4.1 曠場實驗 神經行為學評估結束后，通過Smart系統記錄100 cm×100 cm的觀察箱中大鼠的站立次數及5 min運動的路程，評估其自主活動能力；每換一只大鼠，均使用75%乙醇擦去殘留氣味以避免對后續實驗的干擾。

1.4.2 水迷宮實驗 將水池（直徑150 cm，水深25 cm）劃分為均等的4個象限，將黑色圓形平臺（高22 cm，直徑12 cm）放置在距第一象限池壁35 cm處，距水面約3 cm，大鼠從第三象限入水，引至平臺停留20 s，推入水中再次尋找平臺，訓練5 d（4次/d），于第6天移去平臺，計算機攝像系統觀察大鼠運動軌跡并記錄從入水至平臺的時間（記為逃避潛伏期）及穿越平臺次數，評估大鼠認知功能。

1.5 TUNEL法檢測大鼠神經細胞凋亡情況 每組隨機抽取5只大鼠，處死并取其腦組織于多聚甲醛中固定，制作4μm常規石蠟切片，一部分使用蛋白酶K孵育（8 min）后加入平衡緩沖液處理（10 min），再添加rTdT緩沖液（50μL）避光孵育1 h，DAPI染核，封片，熒光倒置顯微鏡觀察、拍照，觀察缺血部位大腦皮質凋亡（陽性）細胞表達，Image J軟件統計陽性細胞數；另一部分用于免疫組化實驗。

1.6 免疫組化法檢測大鼠腦組織中Iba1表達 將1.5所得石蠟切片室溫復溫15 min后烘烤30 min，脫蠟水化后孵育山羊血清20 min，孵育Iba1一抗（1∶500）過夜，添加生物素標記的二抗（1∶500）孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗、DAB顯色、封片后Image Pro Plus 6.0觀察并計數Iba1陽性表達細胞，實驗重復5次取平均值。

1.7 試劑盒檢測大鼠腦組織中IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平 取其余大鼠腦組織于冰上勻漿，12 500 r/min離心25 min取上清液，一部分按照試劑盒說明書，測定IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平，實驗重復5次取平均值。另一部分行Western blot實驗。

1.8 Western blot檢測CD68、iNOS和Arginase及Nrf2/HO-1通路中相關蛋白表達 取1.7所得腦組織，BCA法檢測勻漿上清液中蛋白濃度，取蛋白樣品30μg進行SDS-PAGE后轉膜、5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗（兔抗CD68、iNOS、Arginase、β-actin、Nrf2、HO-1抗體，均1∶500）孵育過夜，TBST洗滌后山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h，ECL顯影、蛋白凝膠成像儀觀察，Image J分析條帶灰度值，計算CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1水平。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 7統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗結束后神經行為學評分比較 假手術組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組的神經行為學評分（單位：分）分別為0.00±0.00、2.16±0.22、0.69±0.12、1.64±0.25，差異有統計學意義（n=10，F=297.020，P＜0.01）。

2.2 各組曠場實驗和水迷宮實驗結果比較 與假手術組比較，其他各組大鼠運動路程、站立次數及穿越平臺次數減少，逃避潛伏期增加（P＜0.05）；模型組、電針+全反式維甲酸組及電針組運動路程、站立次數及穿越平臺次數依次增加，逃避潛伏期依次減少（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場實驗和水迷宮實驗結果比較（n=10，）

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場實驗和水迷宮實驗結果比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，c與電針組比較，P＜0.05；表2~4同。

組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F曠場實驗運動路程（cm）2 253.30±230.41 852.17±118.80a 1 695.16±161.30ab 1 233.46±127.14abc 133.590＊＊站立次數（次）70.16±6.03 42.57±3.22a 61.07±4.04ab 48.20±3.26abc 84.406＊＊組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F水迷宮實驗穿越平臺次數（次）8.93±1.02 2.04±0.50a 6.25±0.71ab 4.37±0.60abc 158.019＊＊逃避潛伏期（s）14.10±1.12 27.96±2.17a 18.40±1.22ab 22.70±1.46abc 146.818＊＊

2.3 各組大腦皮質神經細胞凋亡、小膠質細胞數量及小膠質細胞形態比較 與假手術組比較，其他各組大鼠大腦皮質神經細胞凋亡率、Iba1陽性細胞數增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組神經細胞凋亡率、Iba1陽性細胞數依次增加（P＜0.05），見表2、圖1。假手術組存在極少量小膠質細胞，胞體瘦長，存在分支狀細長突起，均處于未活化狀態；模型組大鼠小膠質細胞突起增粗、胞體增大、數量增加、處于活化狀態；與模型組比較，電針組小膠質細胞數量減少，突起變細；與電針組比較，電針+全反式維甲酸組小膠質細胞活化數量增加，見圖2。

2.4 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 與假手術組比較，其他各組大鼠腦組織中IL-10水平降低，ROS熒光強度、MDA水平增加（P＜0.05），模型組和電針+全反式維甲酸組IL-1β水平增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組IL-1β水平、ROS熒光強度、MDA水平依次增加，IL-10水平依次降低（P＜0.05），見表3。

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質神經細胞凋亡率及小膠質細胞數量比較（n=5）

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質神經細胞凋亡率及小膠質細胞數量比較（n=5）

組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F細胞凋亡率（%）7.21±1.18 39.16±2.22a 18.69±1.10ab 23.64±2.25abc 278.843＊＊Iba1陽性細胞數（個/視野）4.12±1.02 89.87±9.08a 40.64±5.36ab 68.18±6.37abc 179.359＊＊

Fig.1 The effect of electroacupuncture on neuronal apoptosis in rat cerebral cortex(TUNEL,×400)圖1 電針對大鼠大腦皮質神經細胞凋亡的影響（TUNEL，×400）

Fig.2 Immunohistochemical staining results of microglia(×400)圖2 小膠質細胞免疫組化染色結果（×400）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F IL-1β（mg/g）0.015±0.004 0.050±0.007a 0.023±0.005b 0.038±0.005abc 42.261＊＊IL-10（mg/g）0.053±0.004 0.018±0.003a 0.042±0.005ab 0.030±0.004abc 69.167＊＊ROS熒光強度125.59±18.36 284.74±25.87a 180.15±15.36ab 227.15±16.50abc 60.618＊＊MDA（mmol/mg）3.98±0.28 6.67±0.32a 5.01±0.29ab 5.80±0.30abc 73.946＊＊

2.5 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1相對表達水平比較 與假手術組比較，模型組和電針+全反式維甲酸組大鼠腦組織中CD68、iNOS相對表達水平增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對表達水平降低（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組CD68、iNOS相對表達水平依次增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對表達水平依次降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Effects of electroacupuncture on expression levels of CD68,iNOS and Arginase in rat brain tissue圖3 電針對大鼠腦組織CD68、iNOS和Arginase表達的影響

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達比較 （n=5）

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達比較 （n=5）

組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F CD68 0.80±0.06 1.40±0.21a 0.95±0.09b 1.29±0.21abc 15.896＊＊iNOS 0.58±0.05 1.31±0.22a 0.74±0.11b 1.20±0.20abc 24.134＊＊組別假手術組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F Arginase 1.25±0.21 0.48±0.07a 1.03±0.23b 0.72±0.10abc 20.530＊＊Nrf2 1.38±0.21 0.67±0.09a 1.19±0.18b 0.80±0.10abc 23.185＊＊HO-1 1.49±0.22 0.53±0.08a 1.28±0.21b 0.92±0.11abc 32.054＊＊

3 討論

電針是傳統針灸和電刺激的集合，是一種穩定且快速的治療方法，已用于缺血性中風、抑郁等疾病的治療［11］。然而，目前關于電針對HIBD中小膠質細胞活化的影響及其可能的機制還不甚明了。研究發現，電針能夠通過激活沉默信號調節器1（silence information regulator-1，SIRT1）/叉頭框轉錄因子O亞族1（forkhead box transcription factor O1，FOXO1）信號通路，有效改善腦缺血再灌注損傷鼠血腦屏障、學習及記憶障礙，抑制腦梗死［12］。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠運動路程、站立次數、穿越平臺次數降低，逃避潛伏期增加；而與模型組比較，電針組大鼠運動路程、站立次數及穿越平臺次數增加，逃避潛伏期縮短，表明電針可有效提高HIBD大鼠自主活動及認知能力，改善其認知障礙。Iba1、CD68為小膠質細胞及其活化的標志物，在其活化時表達顯著增加［13］。本研究結果顯示，電針能夠有效抑制HIBD大鼠小膠質細胞過度活化，并在一定程度上促進其由M1型向M2型轉換，由此抑制炎癥反應，改善腦損傷。

當大腦受到損傷時，由于ROS的大量產生，導致小膠質細胞過度活化，釋放大量氧自由基及炎癥介質，加重氧化應激及炎癥反應，形成惡性循環，加重腦損傷［14］。因此，有效抑制氧化應激可避免小膠質細胞的過度活化，減輕腦組織損傷。本研究結果亦顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中ROS、MDA水平增加，表明腦組織中存在氧化應激損傷；而與模型組比較，電針組上述指標水平降低，提示電針可抑制HIBD大鼠腦組織氧化應激。Nrf2作為核因子，在正常狀態下，與Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）相結合，當受到壓力時，會從Keap1中釋放，轉移到核內激活HO-1表達［15］。Nrf2/HO-1作為一個抗氧化通路，在腦損傷中的保護作用已被證實。有研究發現，喜樹堿通過激活AKT/Nrf2/HO-1通路，抑制帕金森病模型小鼠小膠質細胞M1極化，改善神經炎癥反應，從而發揮神經保護作用［16-17］。電針預處理可通過激活Keap1/Nrf2通路來改善創傷后應激障礙模型大鼠的焦慮行為并預防海馬神經損傷［18］。本研究結果亦顯示，與模型組比較，電針組Nrf2及HO-1相對表達水平增加，提示電針可能通過激活HIBD大鼠腦組織中Nrf2/HO-1信號通路來抑制氧化應激，降低炎癥反應，從而改善腦損傷。在電針處理的基礎上使用Nrf2/HO-1通路抑制劑全反式維甲酸處理大鼠結果顯示，全反式維甲酸能夠逆轉電針對HIBD大鼠小膠質細胞活化的抑制作用，加重腦部炎癥損傷及氧化應激反應，表明電針可能通過促進Nrf2/HO-1通路激活來抑制HIBD大鼠小膠質細胞過度活化，并促進小膠質細胞由M1型向M2型轉換，從而改善腦組織炎癥損傷。

綜上所述，電針可能通過激活Nrf2/HO-1通路抑制HIBD大鼠小膠質細胞過度活化，并促進其由M1型向M2型轉換，以此抑制炎癥反應，改善腦組織炎癥損傷。