雷公藤多苷對高糖誘導人腎小管上皮細胞凋亡及CXCL10/CXCR3軸的影響

李明霞，喬海霞，王曉玲，賈麗媛，胡利梅，任衛(wèi)東△

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）屬于糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是引起終末期腎臟病的主要原因，與代謝紊亂、氧化應激、免疫異常、遺傳等多種因素有關［1］。高糖環(huán)境引起的氧化損傷和腎小管上皮細胞的異常凋亡是DN發(fā)展的重要因素［2］。CXC趨化因子配體10（CXC chemokine ligand 10，CXCL10），是一種由多種細胞分泌的促炎性趨化因子，主要與其配體CXC趨化因子受體3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）結(jié)合發(fā)揮生物學功能，參與糖尿病等多種自身免疫性疾病的發(fā)生［3-4］。雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）是從雷公藤根莖中提取的一種脂溶性混合物，可抑制趨化因子、炎性介質(zhì)的產(chǎn)生與釋放，臨床上TG可用于治療類風濕性關節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病、腎病綜合征、銀屑病等多種免疫性疾病［5-6］。研究表明TG能夠降低DN患者尿蛋白，減輕足細胞損傷，保護腎功能［7］。目前，有關TG在DN中的作用機制尚不清楚。本研究通過體外高糖誘導腎小管上皮細胞，并進行不同劑量的TG處理，探討TG對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡及CXCL10/CXCR3軸的影響。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞。人腎小管上皮細胞HK-2（批號SCSP-511）購自上海素爾生物科技有限公司。（2）藥品與試劑。雷公藤多苷片（規(guī)格10 mg，批號20210611）購自浙江得恩德制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號SH30021.01）、胎牛血清（批號SH30072.03）購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素（批號15070063）、胰蛋白酶（批號15050057）購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽比色（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法微量酶反應試劑盒（批號C0009）、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號CA1040）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號CA1410）、蛋白提取試劑盒（批號P0025）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號S0103）購自上海碧云天生物技術公司；腫瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α（批 號SEA133Hu）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1（批號SEA124Hu）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；兔源胱天蛋白酶（Caspase）-3（批號ab184787）、Caspase-9（批號ab32539）、CXCL10（批號ab14969）、CXCR3（批號ab133420）、GAPDH（批號ab234437）一抗、羊抗兔二抗（ab205718）購自英國Abcam公司。（3）儀器。CP-ST100A型CO2培養(yǎng)箱、SpectraMaxiD5型酶標儀購自長沙長錦科技有限公司；Accuri C6型流式細胞儀購自北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司；FCK-40C型熒光顯微鏡購自上海光學儀器廠；WD-9413C型凝膠成像系統(tǒng)購自北京精信達生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HK-2細胞復蘇，接種至含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達到80%左右時進行傳代。

1.2.2 細胞分組與處理 以少量DMEM培養(yǎng)基將TG充分溶解，0.45μm濾膜過濾，用DMEM培養(yǎng)基將TG稀釋至12.5、25、50 mg/L［8］。收集1.2.1中傳至第3代的HK-2細胞，棄原培養(yǎng)基，更換為含5.5 mmol/L葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，將細胞分為對照組（含5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基）、高糖組（含25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基）［9］及12.5、25、50 mg/L TG組（分別用12.5、25、50 mg/L的TG和25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基）［8］。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組重復6次。

1.2.3 MTT法檢測HK-2細胞活性 收集1.2.2中各組HK-2細胞，調(diào)整細胞數(shù)目為1×106個/孔加至96孔板中，每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100μL二甲基亞砜，充分振蕩，酶標儀檢測各孔570 nm波長處光密度（OD）值，計算細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡 收集1.2.2中各組HK-2細胞，以不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心10 min，棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，1 000 r/min離心10 min，吸除上清液；用稀釋好的緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，吸取100μL細胞懸液至流式管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，混勻，遮光孵育5 min，加入10μL碘化丙錠（PI）溶液，混勻，流式細胞儀觀察細胞凋亡。

1.2.5 2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）法檢測HK-2細胞ROS水平 收集1.2.2中各組HK-2細胞，調(diào)整細胞數(shù)目為1×105個/mL，按照ROS檢測試劑盒說明書，棄去細胞原培養(yǎng)基，更換濃度為5μmol/L的DCFH-DA稀釋液，37℃孵育30 min。PBS洗滌細胞3次，流式細胞儀495 nm激發(fā)波長和515 nm發(fā)射波長評估ROS熒光強度，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS熒光圖像。

1.2.6 黃嘌呤氧化酶法檢測HK-2細胞SOD水平 收集

1.2.2 中各組HK-2細胞，4℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清液，超聲勻漿，SOD試劑盒檢測細胞中SOD水平。

1.2.7 ELISA檢測HK-2細胞中炎性因子TNF-α、TGF-β1水平 收集1.2.2中各組HK-2細胞，1 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液，ELISA試劑盒檢測各組細胞中炎性因子TNFα、TGF-β1水平。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測HK-2細胞中凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-9）和CXCL10/CXCR3軸蛋白表達 收集1.2.2中各組HK-2細胞，調(diào)整細胞數(shù)目為1×105個/孔加至24孔板中，蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，定量蛋白濃度后，上樣蛋白樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入Caspase-3（1∶800）、Caspase-9（1∶800）、CXCL10（1∶800）、CXCR3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，蛋白凝膠成像系統(tǒng)成像，Image Pro Plus 6.0圖像軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HK-2細胞活力比較 與對照組比較，高糖組HK-2細胞活力降低（P＜0.05）；與高糖組比較，12.5、25、50 mg/L TG組HK-2細胞活力升高，且隨著TG劑量的升高，HK-2細胞活力逐漸升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of HK-2 cell viability and apoptosis rate between the five groups表1 各組HK-2細胞活力、凋亡率比較（n=6，%）

Tab.1 Comparison of HK-2 cell viability and apoptosis rate between the five groups表1 各組HK-2細胞活力、凋亡率比較（n=6，%）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與高糖組比較，c與12.5 mg/L TG組比較，d與25 mg/L TG組比較，P＜0.05。

組別對照組高糖組12.5 mg/L TG組25 mg/L TG組50 mg/L TG組F細胞活力100.00±0.00 62.75±3.46a 76.42±3.21b 85.14±3.89bc 93.22±4.16bcd 116.531＊＊細胞凋亡率8.34±1.84 36.75±2.73a 29.63±2.19b 21.56±1.95bc 11.42±1.54bcd 197.208＊＊

2.2 各組HK-2細胞凋亡率比較 與對照組比較，高糖組HK-2細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖組比較，12.5、25、50 mg/L TG組HK-2細胞凋亡率降低，且隨著TG劑量的升高，HK-2細胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05），見表1、圖1。

2.3 各組HK-2細胞ROS、SOD水平比較 與對照組比較，高糖組HK-2細胞ROS水平升高，SOD水平降低（P＜0.05）；與高糖組比較，12.5、25、50 mg/L TG組HK-2細胞ROS水平降低，SOD水平升高，且隨著TG劑量的升高，HK-2細胞ROS水平逐漸降低，SOD水平逐漸升高（P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of ROS and SOD levels of HK-2 cells between the five groups表2各組HK-2細胞ROS、SOD水平比較（n=6）

Tab.2 Comparison of ROS and SOD levels of HK-2 cells between the five groups表2各組HK-2細胞ROS、SOD水平比較（n=6）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與高糖組比較，c與12.5 mg/L TG組比較，d與25 mg/L TG組比較，P＜0.05。

組別對照組高糖組12.5 mg/L TG組25 mg/L TG組50 mg/L TG組F ROS（熒光強度）100.49±8.17 254.39±14.54a 207.58±13.47b 162.71±10.32bc 112.88±9.47bcd 190.452＊＊SOD（U/mL）16.72±1.96 7.41±0.77a 9.12±0.98b 11.36±1.25bc 14.58±1.47bcd 48.180＊＊

2.4 各組HK-2細胞炎性因子TNF-α、TGF-β1水平比較 與對照組比較，高糖組HK-2細胞TNF-α、TGF-β1水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，12.5、25、50 mg/L TG組HK-2細胞TNF-α、TGF-β1水平降低，且隨著TG劑量的升高，HK-2細胞TNF-α、TGF-β1水平逐漸降低（P＜0.05），見表3。

2.5 各組HK-2細胞凋亡蛋白、CXCL10、CXCR3蛋白表達比較 與對照組比較，高糖組HK-2細胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表達升高（P＜0.05）；與高糖組比較，12.5、25、50 mg/L TG組HK-2細胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表達降低，且隨著TG劑量的升高，HK-2細胞4種蛋白表達逐漸降低（P＜0.05），見表4、圖3。

Fig.1 The apoptosis of HK-2 cells in each group detected by flow cytometry圖1 流式細胞術檢測各組HK-2細胞凋亡

Fig.2 ROS fluorescence image of HK-2 cells observed by fluorescence microscope(×200)圖2 熒光顯微鏡觀察HK-2細胞ROS熒光圖像（×200）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors TNF-αand TGF-β1 levels of HK-2 cells between five groups表3 各組HK-2細胞炎癥因子TNF-α、TGF-β1水平比較（n=6，ng/L，）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors TNF-αand TGF-β1 levels of HK-2 cells between five groups表3 各組HK-2細胞炎癥因子TNF-α、TGF-β1水平比較（n=6，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與高糖組比較，c與12.5 mg/L TG組比較，d與25 mg/L TG組比較，P＜0.05。

組別對照組高糖組12.5 mg/L TG組25 mg/L TG組50 mg/L TG組F TNF-α 21.44±3.56 68.79±7.11a 55.36±6.68b 35.42±4.45bc 24.91±3.13bcd 90.086＊＊TGF-β1 25.39±4.37 77.92±7.81a 61.43±5.76b 45.72±5.11bc 31.24±4.69bcd 87.014＊＊

Tab.4 Comparison of protein expressions of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 in HK-2 cells between the five groups表4 各組HK-2細胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表達比較 （n=6）

Tab.4 Comparison of protein expressions of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 in HK-2 cells between the five groups表4 各組HK-2細胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白表達比較 （n=6）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與高糖組比較，c與12.5 mg/L TG組比較，d與25 mg/L TG組比較，P＜0.05。

CXCR3 0.19±0.03 0.83±0.11a 0.62±0.09b 0.41±0.07bc 0.24±0.04bcd 77.794＊＊組別對照組高糖組12.5 mg/L TG組25 mg/L TG組50 mg/L TG組F Caspase-3 0.21±0.03 0.73±0.09a 0.58±0.07b 0.39±0.04bc 0.28±0.03bcd 84.457＊＊Caspase-9 0.31±0.04 0.84±0.10a 0.72±0.08b 0.56±0.06bc 0.41±0.05bcd 58.718＊＊CXCL10 0.26±0.03 0.77±0.08a 0.61±0.07b 0.49±0.04bc 0.31±0.03bcd 90.857＊＊

Fig.3 Western blot assay of Caspase-3,Caspase-9,CXCL10 and CXCR3 of HK-2 cells in each group圖3 各組HK-2細胞Caspase-3、Caspase-9、CXCL10、CXCR3蛋白印跡圖

3 討論

DN早期主要表現(xiàn)為尿蛋白增多、腎小球病變，彌漫性和結(jié)節(jié)性系膜擴張和腎小球基底膜增厚是DN患者最顯著的病理改變［10］。腎小管上皮細胞是腎小管間質(zhì)的主要細胞，能夠過濾對腎小球有用的物質(zhì)，腎小管上皮細胞凋亡和損傷會導致腎小球濾過膜功能障礙，從而誘導慢性腎臟病的發(fā)生［11］。腎小管細胞損傷過程中涉及氧化應激、炎癥和細胞凋亡等過程，高糖環(huán)境導致腎臟組織中過量ROS的產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應激反應，造成線粒體功能障礙，能量代謝不足，引起腎小管細胞凋亡和損傷［12］。本研究結(jié)果表明，高糖誘導促進HK-2細胞的凋亡，ROS及炎性因子TNF-α、TGF-β1的產(chǎn)生，抑制SOD水平，與Xie等［13］研究結(jié)果相似，提示DN發(fā)生與氧化應激、腎小管上皮細胞凋亡以及炎癥反應有關，具體機制有待進一步研究。

趨化因子由多種細胞分泌，具有炎癥趨化特性，在免疫應答過程中，趨化因子能夠趨化活化的T淋巴細胞、單核細胞等，通過G蛋白偶聯(lián)受體進入炎癥損傷區(qū)發(fā)揮促炎作用［14］。CXCL10由干擾素-γ（IFN-γ）誘導產(chǎn)生，又被稱為干擾素-γ-可誘導蛋白10，為1型糖尿病自身免疫破壞的驅(qū)動因子。有文獻報道，CXCL10的高表達可加速糖尿病發(fā)展，CXCR3是CXCL9、CXCL10、CXCL11的共同受體，分布于活化的T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞的表面［15］。Du等［16］研究表明，CXCR3可通過誘導線粒體功能障礙促進非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生。Li等［17］研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的足細胞中CXCR3表達顯著上調(diào)，而沉默CXCR3能夠抑制高糖誘導的足細胞凋亡以及炎性因子TNF-α和白細胞介素-6（IL-6）的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組CXCL10、CXCR3蛋白表達升高，提示CXCL10/CXCR3軸可能與DN發(fā)生有關。

TG是一種植物免疫抑制劑，對DN、免疫球蛋白（Ig）A腎病具有一定的療效［6］。楊忠民等［18］研究表明，TG能夠改善IgA腎病大鼠腎功能，減輕大鼠腎組織病理損傷。Wu等［19］研究表明，TG能夠抑制DN大鼠腎小球巨噬細胞浸潤，抑制TNF-α、TGF-β1等炎性因子的過表達，改善大鼠腎小球硬化。本研究結(jié)果表明，TG能夠抑制高糖誘導的HK-12細胞的凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達，并抑制細胞內(nèi)ROS、TNF-α和TGF-β1的產(chǎn)生，增加細胞中SOD水平，提示TG可能通過抑制腎小管上皮細胞凋亡在DN治療中發(fā)揮作用，推測可能是TG抑制了高糖誘導的氧化應激和炎癥反應，進而抑制HK-12細胞的凋亡，具體機制有待進一步研究。杜穎等［20］研究表明，TG聯(lián)合異甘草酸鎂治療能夠降低自身免疫性肝炎患兒血清CXCL10的水平，減輕機體炎癥反應。本研究進一步發(fā)現(xiàn)TG組HK-2細胞CXCL10、CXCR3蛋白表達低于高糖組，提示TG尤其是高劑量TG能夠抑制高糖誘導的HK-2細胞中CXCL10/CXCR3軸的活性，這可能是TG抑制HK-2細胞凋亡及治療DN的機制。

綜上所述，TG可抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，其機制可能與抑制CXCL10/CXCR3軸有關，這可能是TG治療DN的機制。然而，本研究僅從體外水平分析了TG對CXCL10/CXCR3軸和HK-2細胞的影響，下一步需結(jié)合體內(nèi)實驗進一步分析TG與DN發(fā)生過程中CXCL10/CXCR3軸和腎小管上皮細胞凋亡的關系。