類風濕性關節炎潛在治療中藥的生物信息學預測*

姚承佼，李奕霖，熊欽，羅利紅，謝鳳嬌，李廷林，謝文光，周京國，馮培民

1.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072； 2.川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637007；3.成都醫學院第一附屬醫院，四川 成都 610500

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、侵蝕性、多關節炎為主要表現的致殘性自身免疫性疾病[1]，嚴重影響著世界上0.5%～1.0%的人群[2]，但其臨床緩解率卻僅有8.6%。RA病因尚不完全明確，多重研究發現遺傳易感性、免疫失衡、腸道菌群、神經內分泌、環境因素等相互交織，彼此聯系[2]，故RA又被認為是具有遺傳傾向的多因子復雜性疾病，其中，以基因和遺傳易感性為主導的發病機制研究一直是RA研究的焦點。目前，西醫尚無可根治RA的藥物，臨床治療多使用改善病情抗風濕藥、生物制劑、合成小分子靶向藥物等，但上述藥物常出現如嚴重感染、骨髓抑制、肝腎功能受損、消化道反應等不良反應，且費用較高，常需要聯合用藥，極大增加了患者和社會的醫療成本。

中醫將RA歸屬“痹證”“尪痹”“頑痹”的范疇[3]，有數千年的治療歷史，理論及經驗積累豐富，早在《素問·痹論》中就有對其成因的描述，“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，強調風寒濕外邪致病，該篇中“榮者水谷之精氣也……衛者水谷之悍氣也……逆其氣則病，從其氣則愈，不與風寒濕氣合，故不為痹”，強調內因致病的重要性。后世醫家在內經理論基礎上發展了“熱”“瘀”“虛”等致“痹”的理論，逐漸形成了完備的辨證論治體系[4]。中醫辨證施治，以內、外治聯合，中西醫結合，在控制RA病情進展及改善患者生活質量方面取得進展，顯示了中醫的臨床優勢[5]。單味中藥雷公藤、白芍、青風藤等，經典復方如桂枝芍藥知母湯、黃芪桂枝五物湯、獨活寄生湯等，以及火針、艾灸、蜂針輸穴等中醫療法有抗炎、鎮痛、免疫調節的功效，可極大的改善痹證病情，緩解癥狀，改善關節功能[6-8]。中醫藥現代研究發現，治療RA的中藥單體成分繁多，包括生物堿、黃酮類、苯丙氨酸等，其可能涉及的下游通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核轉錄因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)等介導的經典通路[9]。但中醫治療缺乏標準的量化指標，藥物單體難以提取，療效背后潛在的分子機制尚不明確，故讓中醫在國際范圍內的推廣造成困難，為中西醫結合造成困頓。

基因芯片技術因具有高通量、高速度、低成本和集約化的特點，已成為目前研究疾病基因和遺傳特性的主流手段之一。基因芯片技術結合應運而生的生物信息學分析，為深入挖掘RA發病機制、生物標記物，探索潛在治療靶點、早期診斷指標開辟了新的思路。本研究運用現代醫學的基因芯片技術，結合生物信息學分析的方法，從基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[10]中提取原始數據，挖掘RA差異表達基因(differentialy expressed genes，DEGs)和其對應的生物學功能及信號通路，并將其與中藥治療靶點相互映射，用以探尋RA高危預警、診斷和治療的中西醫結合之路，為新藥研發提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 數據提取在GEO數據庫中提取GSE1919、GSE55235、GSE55457數據集的基因片段原始數據，僅保留RA患者和對照組正常人群的關節滑膜組織樣本以作進一步分析，其中三個數據集的RA關節滑膜組織均取自關節置換術或者開放性滑膜切除術的RA患者。各基因芯片數據集包含樣本例數、芯片平臺等相關詳細信息。見表1。

表1 RA和對照組基因芯片的相關基本信息

1.2 DEGs篩選GEO2R(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個基于Limma R包用于比較GEO數據庫中兩個或者多個數據集差異表達基因的交互式網絡工具，廣泛運用于各種芯片的數據分析處理。利用在線分析工具GEO2R分別篩選3個基因芯片數據集中的差異表達基因，當基因差異表達log2FC絕對值>2，P<0.05時差異有統計學意義。利用韋恩圖(http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對3個數據集的差異表達基因取交集，獲得最終DEGs。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析DAVID數據庫(https：//david-d.ncifcrf.gov/)[13]是集基因注釋、可視化、數據挖掘、分析整理為一體的在線生物信息學資源庫。GO是一種重要的基因注釋生物學過程分析的生物信息工具。KEGG以從分子水平了解生物系統功能和實用程序而著稱，是國際上最常用的生物信息數據庫之一。使用DAVID對DEGs進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，以 FDR<0.05視為差異有統計學意義。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction network，PPI)網絡構建及重點基因篩選STRING(https：//string-db.org/)[14]是預測功能性蛋白互作網絡的在線平臺。深入了解不同蛋白質在功能上的相互關系，可為深入認識疾病的發病機制及預后判斷提供可靠的依據。利用STRING數據庫對DEGs進行PPI構建，篩選標準為combined score>0.4。Cytoscape是生物信息學分析中用于網絡可視化分析的一個重要的開源分析工具[15]。使用Cytoscape3.7.0軟件及CytoHubba插件篩選DEGs中的重點基因。CytoHubba插件根據nodes在網絡中的屬性進行排名，包含11種拓撲分析方法，degree值更高的基因更傾向于是重點基因。用MCODE插件對篩選出的重點基因進行模塊分析，篩選條件為MCODE score>5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k score=2。

1.5 重點基因驗證及關鍵基因篩選在GEO數據庫中提取GSE77298數據集的基因片段原始數據，并在GSE77298數據集中驗證篩選出的重點基因的表達，去掉表達趨勢相反的重點基因，并將表達趨勢一致的重點基因定義為關鍵基因。

1.6 靶點對接及中藥預測將篩選的關鍵基因分別映射到Coremine Medical(http：//www.coremine.com/)中，篩選出與關鍵基因相關的中藥，P<0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEGs篩選結果基于GSE1919、GSE55235、GSE55457基因芯片數據集，利用在線分析工具GEO2R篩選RA共同DEGs 33個，其中包括32個表達上調的DEGs和1個表達下調的DEGs。DEGs交集韋恩圖見圖1。篩選出的DEGs名稱標注在火山圖上，圖中橫坐標表示基因表達差異的倍數，縱坐標表示P值，綠色點表示表達下調的基因，紅色點表示表達上調的基因，藍色的點表示表達上調的DEGs，粉色的點表示表達下調的DEGs。見圖2。

圖2 RA差異表達基因火山圖

2.2 PPI構建和重點基因篩選將DEGs導入STRING數據庫構建PPI網絡。DEGs的PPI網絡由45個節點和209條邊構成，見圖3。使用Cytoscape中的CytoHubba插件篩選重點基因，依據參數Degree值排名，選擇排名前10位的DEGs為重點基因，見表2，并使用MCODE插件進行模塊分析。結果顯示，CD27、CD79A、CXCL9、CXCL10、CXCL13、CCL5、CD3D、LCK、TNFRSF17、CCL8這10個DEGs是在RA發生發展及病情評估中起重要作用的重點基因。重點基因PPI網絡由10個節點和22條邊構成，見圖4，使用Cytoscape中的MCODE進行模塊分析，并最終得到一個重要模塊：CD27、CXCL10、CCL5、CXCL9、CXCL13，見圖5。

圖3 DEGs的蛋白互作網絡圖

圖4 重點基因的蛋白互作網絡圖

圖5 重點基因中的重要模塊

表2 PPI網絡中的重點基因

2.3 重點基因驗證及關鍵基因篩選通過GSE77298原始數據集驗證重點基因的表達。結果發現：在GSE77298數據集中，RA患者滑膜組織中CD27、LCK表達下降，而在GSE1919、GSE55235、GSE55457數據集中，RA患者滑膜組織中CD27、LCK表達上升，故將兩者刪除。其余8個重點基因在四個數據集中的表達趨勢相同，定義為關鍵基因。

2.4 中藥預測結果Coremine Medical數據庫是一個集中草藥、基因本體論、蛋白表達、解剖等醫學綜合信息的開放檢索平臺。將篩選到的8個關鍵基因映射到Coremine Medical數據庫，共篩選出可能治療RA的中藥172種，以P<0.05視為有統計學意義，共篩選出靶向中藥52種。按照《中藥學》[16]將靶向中藥進行分類發現，篩選出的靶向中藥主要為清熱涼血藥(白藥子、苦參、苦瓜、茶樹根、臭靈丹草、連翹、雷公藤、夏枯草、板藍根、通關藤、魚腥草、崗梅根、臭椿皮、紫草、地榆、栘枍)、祛風散寒藥(青風藤、姜皮、干姜、花椒、紅豆寇、鵝不食草、椒目、生姜、眼鏡蛇、八角茴香)和活血祛瘀藥(丹參、沒藥、毛冬青、合歡花)。這些篩選出的中藥可能作為RA治療潛在藥物來源。見表3。選擇部分清熱涼血藥物，通過Coremine Medical數據庫驗證其所涉及生物過程。其中，雷公藤與樹突狀細胞遷移、核轉錄因子kappa B(nuclear factor kappa，B，NF-κB)轉錄因子調節、細胞凋亡過程關系緊密。通關藤與細胞周期停滯、凋亡過程、細胞自噬、細胞周期調控關系密切。而祛風通絡的青風藤與白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)產生過程、滑膜細胞增殖、炎癥反應負調控、細胞凋亡過程密切相關。

表3 關鍵基因中藥預測結果

2.5 DEGs的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析GO分析涵蓋分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)和生物過程(biological process，BP)三個大方面。對DEGs進行GO分析可知，MF主要涉及趨化因子活性(chemokine activity)、免疫球蛋白受體結合(immunoglobulin receptor binding)、抗原結合(antigen binding)、肽聚糖結合等。CC主要集中在質膜外側、細胞外間隙、細胞外組分、質膜、IgM免疫球蛋白復合物等。DEGs涉及的生物過程主要集中在免疫應答、B細胞受體信號轉導過程、適應性免疫反應、趨化因子介導的信號通路、免疫反應調節、細胞信號轉導、細胞增殖調節等。KEGG信號通路分析結果表明，DEGs主要富集在細胞因子間受體相互作用、趨化因子信號通路、原發性免疫缺陷、Toll樣受體信號通路等。見表4，圖6。

表4 DEGs涉及的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

注：A：分子功能(molecular function，MF)；B：細胞組分(cell component，CC)；C：生物過程(biological process，BP)；D：KEGG信號通路圖6 DEGs涉及的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

3 討論

類風濕性關節炎是一種致炎過程極其復雜的自身免疫性疾病，其發病是多基因、環境、飲食等共同演變的過程。目前，已發現趨化因子及其受體(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CCL9、CCL3等)[17]、自噬相關因子(Atg、ULK1、LC3等)[18]、凋亡相關因子(Bcl-2、Bax、GG2-1等)[19]及Toll樣受體、JAK-STAT、Wnt/β-catenin等[20-21]信號通路相關的多個基因的異常表達均參與RA的發生發展。故而，利用基因芯片技術從基因組上研究RA疾病發生進展的機制，以期能起到事半功倍的效果。

本研究在GEO數據庫中提取多個基因芯片數據，結合生物信息學分析挖掘RA差異表達基因，結果發現，RA患者與健康對照者之間存在33個差異表達基因。GO分析和KEGG分析顯示，差異表達基因與免疫失衡關系密切。通過Cytoscape軟件中的CytoHubba插件和MCODE模塊分析，以及GSE77298數據集進一步驗證，得到參與RA發生發展的8個關鍵DEGs。

關鍵DEGs中CXCL9、CXCL10、CXCL13、CCL5、CCL8屬于趨化因子及其受體家族，而CD79A、CD3D、TNFRSF17則在T/B細胞分化發育成熟及信號傳導過程中發揮重要作用。趨化因子可通過定向趨化免疫細胞，經過多途徑影響體液免疫、細胞免疫和炎癥反應過程。CCL5是趨化因子CC家族重要成員之一，可定向誘導T細胞趨化游走、聚集活化，是一種典型的炎癥源性趨化因子。CCL5與受體CCR5通過受體內吞的方式結合后形成CCL5/CCR5軸，特異性表達于活化的Th1細胞表面，選擇性的誘導Th1細胞聚集在類風濕性關節炎患者關節滑膜及滑液內，并刺激Th1細胞產生大量IFN-α、TNF-α、IL-1等炎癥細胞因子，激活炎癥信號通路造成關節持續性的病理損害[22]。研究發現，RA患者關節腫脹指數與CCR5表達量顯著相關[23]，使用CCL5抑制劑后，關節炎癥狀得到有效緩解，并能有效阻斷炎癥因子風暴[24]。中藥雷公藤對類風濕性關節炎中CCL5表達的抑制作用顯著，并能有效緩解關節疼痛，減輕關節腫脹。趨化因子CXCL9、CXCL10則可與大量表達于Th1細胞表面的趨化因子受體 CXCR3 特異性結合，從而發揮趨化作用。CXCL10與CXCR3結合后，一方面促進T細胞分化為CD4+Th1細胞，另一方面誘導RANKL表達于破骨細胞前體[25]，影響MMP-1活性，導致RA骨侵蝕破壞，故在RA滑膜內可見大量CXCR3表達，且滑膜液內CXCL9和CXCL10含量明顯升高，以利于CXCR3表達的炎癥細胞從血液遷移至滑膜內[25]。趨化因子CXCL13可與B淋巴細胞表面的受體CXCR5特異性結合，激活Rap并加速細胞質酪氨酸激酶Pyk2磷酸化，達到定向趨化B細胞的目的[26]。在RA中，CXCL13被認為是一個早期的生物標記物，其水平高低可準確地評估RA滑膜炎的嚴重程度。另有研究發現，CXCL13可趨化Tfh細胞定向轉移到淋巴濾泡，刺激其產生抗CCP抗體，促進RA的發生發展[27]。

同時，本研究預測出DEGs的KEGG信號通路主要富集在細胞因子間受體相互作用、趨化因子信號通路、原發性免疫缺陷、Toll樣受體信號通路等。既往針對RA的生物信息學分析中發現，細胞因子間受體相互作用、趨化因子信號通路在RA的發生發展中起到了重要作用[28]，與本研究的預測不謀而合。另一項針對類風濕性關節炎細胞因子間相互作用的研究發現，RA是一種Th1細胞介導的以細胞免疫反應損傷為主的疾病[29]。Toll樣受體在先天性和適應性免疫反應中均起重要作用，研究發現，RA滑膜細胞受到LPS刺激后可導致Toll樣受體信號通路活化，炎癥因子大量釋放，最終導致關節滑膜的自身免疫性炎癥和嚴重的組織損害[30]。而白芍總苷則可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，改善關節炎癥癥狀，降低炎癥反應，并促進關節滑膜組織細胞的凋亡[31]。當歸四逆湯可通過調節TLR/Beclin-1通路關鍵節點信號蛋白表達，對類風濕性關節炎模型大鼠關節組織起到有效保護作用[32]。雷公藤內酯醇則可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路表達，降低炎性因子的產生，減少炎性反應[33]。

RA在中醫上沒有特定的病名，但依據本病主癥特點，多將其歸屬“痹病”“尪痹”“頑痹”“骨痹”等范疇。“痹”這一病名起始于《素問·痹論》：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕勝者為著痹?！薄秱浼鼻Ы鹨健ぶT風》中記載：“歷節風著人，久不治者，令人骨節蹉跌……古今以來，無問貴賤，往往苦之，此是風之毒害者也。”由此可見，外感六淫中的風、寒、濕三邪是痹證產生的主要外因，而葉天士《臨證指南醫案》中提到“濕熱流著，四肢痹痛。”《諸病源候論》：“熱毒氣從臟腑出，攻于手足，手足則焮熱赤腫疼痛也”，則進一步提出了“熱毒致痹”的觀點，即是外感偏盛的風、寒、濕之陰邪從濕熱進展為熱痹[34]。由上述病機聯系證候，可將痹癥分為“風寒濕痹”和“熱痹”兩種。RA活動期常表現為關節腫脹，表皮溫度升高，壓痛明顯，疼痛劇烈，活動受限，實為“風寒濕邪內侵或內生濕邪久蘊不解，化熱釀毒滯瘀，以致熱毒濕瘀互結，痹阻經絡骨髓”所指的“熱痹”[34]。而在RA非活動期，風寒濕邪侵襲機體，痹阻經絡，經絡失和，氣血運行不暢，寒性收引凝滯，關節以冷痛，屈伸不利為主，多為“風寒濕痹”[35]。在疾病活動期施以雷公藤、地骨皮、苦參、苦瓜、茶樹根等清熱藥，結合青風藤、紅豆寇等祛風藥物，暗合“熱痹”治療清熱解毒，祛濕通絡、活血止痛的治標原則；而在疾病非活動期以山藥、黃芪等扶正藥物，配伍丹參、沒藥活血，輔以干姜、花椒散寒，則體現了治療“風寒濕痹”以扶正為主，兼化瘀祛風通絡，溫經散寒的治本原則。

將前文中篩選出的關鍵基因映射到Coremine Medical數據庫，以篩選對RA可能有效的中藥。篩選的中藥中，雷公藤有清熱涼血，行氣通絡功效，在臨床治療RA應用已久?！侗静菥V目》記載雷公藤味苦辛，性寒，有大毒。中醫利用其毒性，以“以毒攻毒”的中醫原理，治療痹癥之“毒”。研究發現其能有效阻斷CCL5的表達，抑制IL-1/IL-17/IL-18等多種炎癥因子及炎癥通路，抑制VEG和/MMP-9表達，有效改善CRP、血沉、RF等指標及DAS評分[36]。另外，預測出的藥物中還有青風藤、通關藤和雷公藤這幾種藤類植物。古書有云“凡藤蔓之屬，皆可通經入絡，此物善治風疾，故一切歷節麻痹皆治之”。臨床研究發現，青風藤湯能顯著降低RA患者體內的Tfh細胞及IL-21水平，有效延緩疾病發展，改善患者臨床癥狀[37]。雷公藤內酯醇則可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路表達，降低炎性因子的產生，減少炎性反應[33]。連翹酯苷A是連翹的有效成分，其可通過抑制炎癥因子TNF-α的含量，并干擾TNF-α蛋白的翻譯，影響抗氧化酶及自由基含量，最終發揮抗炎功效[38]。氧化苦參堿可通過調控RA患者IL-6、TNF-α、CRP水平，明顯改善RA的免疫功能，降低炎癥因子水平，減輕關節癥狀[39]。這說明通過現代生信技術預測的結果與千百年來總結的經驗一致。

本研究發現，RA中的DEGs在分子功能、細胞組成、生物過程和信號通路上均與適應性免疫密不可分。通過生物信息學方法預測出的靶向中藥可能成為治療RA的潛在藥物，為后續分子機制的挖掘以及診斷治療、新藥開發提供了重要的參考價值。未來須進一步結合體內外實驗來驗證相關中藥的療效，進一步探索其潛在的治療靶點。