麥冬乙醇提取物調控鐵死亡抑制肺腺癌A549細胞活性*

范修琦，高穩東，陳玉龍，韓懿存，孟偉，樊李妍，高啟龍

1.鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

肺癌是當今世界上最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球肺癌發生率和死亡率分別占全部惡性腫瘤的11.4%和18.0%[1]。隨著免疫療法的發展，肺癌的治療手段已經非常多樣化，但其死亡率仍然很高。因此，探究肺癌的發生機制，尋求新的治療靶點，對于肺癌的治療非常重要。鐵死亡(ferroptosis)是近年發現的一種鐵離子依賴性的非凋亡性細胞死亡形式，主要由細胞中脂質過氧化物(lipid reactive oxygen species，lipid ROS)積累引起[2]。鐵死亡作為非凋亡性細胞死亡形式，已逐漸成為清除抵抗凋亡腫瘤細胞的新策略。腫瘤細胞的生長和分裂需要大量能量，而產能過程中伴隨著氧化應激和活性氧的積累，此外，腫瘤細胞中存在著應對氧化應激的基因突變，賦予腫瘤細胞生長優勢，使其對鐵死亡的抵抗力增強[3]。

中醫藥在癌癥的輔助治療中發揮著重要作用，鐵死亡這一新型的死亡方式為中醫藥抗腫瘤的研究提供了新的靶點。麥冬是一味傳統中藥，歸心、肺、胃經，具有養陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效。多項研究證實，麥冬及其有效成分可通過促進細胞自噬、凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲、遷移等途徑發揮抗腫瘤作用[4-5]。此外，麥冬皂苷D(ophiopogonin D，OP-D)能通過調節脂肪酸代謝對抗心肌細胞氧化作用[6]，并能通過干預內質網應激和鐵死亡途徑降低麥冬皂苷D′的心臟毒性[7]。本課題組前期通過水煎提取、醇浸提取、水提醇沉等多種提取工藝提取麥冬的有效成分，發現麥冬水提物及水提醇沉物對A549細胞沒有明顯的細胞毒作用，而麥冬乙醇提取物能抑制A549細胞活性，具有明顯的細胞毒性。研究發現，麥冬水提及水提醇沉法所得到的多糖成分居多[8]，而經醇提所得的化合物則以皂苷類為主[9]。麥冬乙醇提取物能抑制A549細胞活性，但具體分子機制并不明確，對于其是否能調控細胞鐵死亡尚未有研究。本文將通過考察麥冬乙醇提取物對A549細胞的毒性作用，研究其抑制A549細胞活性與鐵死亡的關系，進一步探討麥冬乙醇提取物抗腫瘤的分子機制。

1 材料

1.1 細胞人肺腺癌A549細胞株由河南中醫藥大學方證信號轉導實驗室饋贈。

1.2 藥物與試劑麥冬[中國北京同仁堂(集團)有限公司，批號：20101004]。無水乙醇(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司，批號：21061223)；DMEM高糖培養基、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量檢測試劑盒、ECL Plus超敏發光液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：12100、P1020、T1320、M1020、D8370、BC1175、PE0010)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，上海雙洳生物科技有限公司，貨號：S711-001S)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0146)，蛋白Marker(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：26616)；Anti-Keap1抗體、Anti-Nrf2抗體、Anti-NOX1抗體、Anti-COX2抗體、Anti-FHC、Anti-FACL4抗體(英國abcam公司，貨號：ab139729、ab62352、ab131088、ab179800、ab75972、ab155282)；GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔 IgG抗體(美國CST公司，貨號：2118S、7074S)；ReverTra Ace qPCR RT Kit[東洋紡(上海)生物科技有限公司，貨號：FSQ-101]；2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix(武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號：RM21203)。

1.3 儀器超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：37997)；CO2培養箱(德國Eppendorf 公司，型號：170R)；倒置顯微鏡(德國LEICA公司，型號：DFC450C)；電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司，型號：XB120A)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52AA)；真空泵(河南鞏義市英峪華中儀器廠，型號：SHZ-D)；冷凍干燥機(北京四環起航科技有限公司，型號：LGJ-12A)；流式細胞儀(美國BD公司，型號：FACSCalibur)；酶標儀(美國BIO-TEK公司，型號：ELx-800)；凝膠成像掃描儀(美國BIO-RAD公司，型號：ChemiDoc XRS+)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：QuantStudio 6)。

2 方法

2.1 藥物制備稱量麥冬50 g并粉碎，按質量體積比1：10的比例加入70%乙醇500 mL，避光冷浸1周，每天攪拌1次，1周后過濾，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清，旋轉蒸發，回收乙醇，濃縮并干燥成膏狀，稱量收集藥物的質量，計算出膏率。出膏率=提取物質量/生藥質量×100%=0.090 8 g/50 g=0.181 6%。使用時先用DMSO配置藥物母液250 g·L-1，再用培養基配置成濃度為50 g·L-1的中間工作液，給藥時用培養基分別配置成濃度為400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的溶液。

2.2 細胞培養10% FBS與90% DMEM高糖培養基混勻，配制成完全培養基，在37 ℃、5%CO2濃度及飽和濕度下培養A549細胞，每3～4 d傳代一次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。

2.3 MTT檢測麥冬乙醇提取物對A549細胞活性的影響調整A549細胞密度至4.0×104mL-1，接種于96孔板中，每孔200 μL，培養24 h后，分別加入濃度為400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的含藥培養基，對照組加入完全培養基，每組設5個復孔，周圍用PBS封邊，設為空白孔；培養 48 h 后，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g·L-1)的DMEM培養基，培養4 h后每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻，孔內甲臜結晶完全溶解后，測定570 nm波長處光吸收值。

細胞活性=(OD給藥孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)×100%

2.4 流式細胞術檢測A549細胞凋亡調整A549細胞密度至1.5×105mL-1，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養24 h后分別加入濃度200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養基，培養48 h后，收集培養基上清，用不含EDTA的胰酶消化細胞并收集，PBS清洗并收集孔內殘留細胞，做好標記，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS清洗兩遍后加入稀釋好的1×Buffer，于避光處每管加入 10 μL Annexin V和5 μL PI染色液染色，輕微震蕩混勻后，避光孵育10 min，上機檢測。

2.5 A549細胞中GSH含量變化檢測調整A549細胞密度至1.25×105mL-1，接種于培養皿中，每皿8 mL，培養24 h后分別加入濃度為200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養基，培養48 h后，用胰酶消化細胞并收集，600×g離心10 min，棄上清，用PBS清洗兩遍后，加入3倍細胞沉淀體積的試劑重懸細胞，于液氮中速凍，并用37 ℃水浴溶解，反復凍融3次后，8 000×g離心10 min，收集上清。按照試劑盒說明書操作配置標準曲線并測量GSH的含量，實驗重復3次。

2.6 Western Blot檢測A549細胞FHC、COX2、FACL4、Keap1、Nrf2蛋白表達水平調整A549細胞密度至1.25×105mL-1，接種于培養皿中，每皿 8 mL，培養24 h后分別加入濃度為200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養基，培養48 h后，BSA提取細胞總蛋白后采用BCA法檢測蛋白濃度，然后進行蛋白變性，配膠，電泳，轉膜，封閉，一抗采用5%脫脂牛奶稀釋(GAPDH、Keap1、Nrf2、FHC按照1：1 000的比例稀釋，COX2稀釋比例為1：2 000，FACL4稀釋比例為1：20 000)，孵育2 h，二抗采用5%脫脂牛奶稀釋(稀釋比例為1：1 000)，孵育1 h，ECL超敏發光液顯色。用BIO-RAD全能型凝膠成像分析系統顯影，目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/內參表達量，分析目標條帶的光密度值。實驗重復3次。

2.7 RT-PCR法檢測A549細胞FHC、COX2、FACL4、Keap1及Nrf2的mRNA表達水平調整A549細胞密度至1.5×105mL-1，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養24 h后分別加入濃度為 200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養基，培養48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA濃度，將RNA在65 ℃條件下進行5 min的預變性，再按照如下反應體系(表1)，在37 ℃條件下進行 15 min 的逆轉錄反應，在98 ℃條件下進行 5 min 的酶失活反應，將RNA逆轉錄為cDNA后冰上配置如下PCR反應體系，添加完畢后小心震蕩混勻并瞬時離心，將配好的反應體系(表1)轉移至PCR板內，光學密封薄膜密封，PCR板2 500 r·min-1離心 60 s，上機進行RT-PCR反應，擴增條件：95 ℃預變性3 min，1個循環，循環反應95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s，40個循環。數據采用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析，考察相關基因mRNA表達水平。引物由河南點睛生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表1 逆轉錄體系及PCR擴增體系

表2 引物序列

3 結果

3.1 麥冬乙醇提取物對A549細胞活性的影響采用MTT法檢測麥冬乙醇提取物對A549細胞活性的影響，結果顯示：麥冬乙醇提取物能明顯抑制A549細胞活性，且抑制作用與濃度成正比。利用SPSS 25.0統計軟件計算出麥冬乙醇提取物對A549細胞的IC30為93.660 mg·L-1，IC50為208.853 mg·L-1。為方便計算，分別選取100 mg·L-1和200 mg·L-1代表IC30和IC50進行后續試驗。見圖1。

圖1 麥冬乙醇提取物對A549細胞活性的影響(n=5)

3.2 麥冬乙醇提取物對A549細胞形態變化的影響顯微鏡下觀察顯示，0 mg·L-1組A549細胞呈梭形；麥冬乙醇提取物作用后，A549細胞數量明顯減少，且 200 mg·L-1組A549細胞體積明顯縮小，胞質固縮。見圖2。

注：A：0 mg·L-1組；B：100 mg·L-1組；C：200 mg·L-1組圖2 A549細胞形態改變(×200)

3.3 麥冬乙醇提取物對A549細胞凋亡的影響采用流式細胞術檢測麥冬乙醇提取物對A549細胞凋亡的影響，結果顯示：與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著提高A549細胞凋亡水平(P<0.01)，且200 mg·L-1組細胞凋亡率顯著高于 100 mg·L-1組(P<0.001)。見圖3及圖4A。

注：A：0 mg·L-1組流式圖；B：100 mg·L-1組流式圖；C：200 mg·L-1流式圖圖3 麥冬乙醇提取物對A549細胞凋亡的影響(n=5)

3.4 麥冬乙醇提取物對A549細胞GSH水平的影響GSH是細胞內重要的抗氧化劑，與鐵死亡呈負相關。結果顯示，與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著降低GSH水平(P<0.01)。見圖4B。

注：0 mg·L-1組比較，**P<0.01；A：麥冬乙醇提取物誘導A549細胞凋亡；B：A549細胞中GSH含量變化圖4 麥冬乙醇提取物對A549細胞的影響(n=5)

3.5 麥冬乙醇提取物對A549細胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表達的影響為了探究麥冬乙醇提取物對A549細胞的抑制作用與鐵死亡的關系，檢測了鐵死亡相關因子FHC、COX2、FACL4蛋白和基因的表達。結果顯示：與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著上調FHC蛋白和mRNA及COX2mRNA的表達水平(P<0.05)。見圖5。

注：A：FACL4、COX2、FHC mRNA表達水平比較；B：FACL4、COX2、FHC蛋白表達水平比較；C：FACL4、COX2、FHC蛋白條帶圖；與0 mg·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 麥冬乙醇提取物對A549細胞FACL4、COX2、FHC蛋白和基因表達的影響(n=3)

3.6 麥冬乙醇提取物對A549細胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表達的影響與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著降低Keap1和Nrf2蛋白及基因的表達水平(P<0.05)。見圖6。

注：A：Keap1、Nrf2 mRNA表達水平比較；B：Keap1、Nrf2蛋白表達水平比較；C：Keap1、Nrf2蛋白條帶圖片；與0 mg·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖6 麥冬乙醇提取物對A549細胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表達的影響(n=3)

4 討論

肺癌惡性程度高，治療效果有限，預后較差，因此尋找新的治療肺癌的途徑至關重要。鐵死亡是一種有別于凋亡、壞死、自噬等方式的新型細胞程序性死亡，細胞中游離鐵經Fenton反應產生活性氧自由基，或通過參與酶促反應誘導膜脂多不飽和脂肪酸氧化[10]。同時，細胞中存在清除脂質過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4，GPX4)、輔酶Q氧化還原酶(CoQ oxidoreductase，FSP1)等抵抗脂質過氧化損傷的保護性機制，使細胞內ROS處于動態平衡狀態。而當細胞中ROS積累過多，GPX4等保護性通路失活時，細胞膜的通透性和穩定性被ROS破壞，最終誘發鐵死亡[11]。肺癌組織普遍有著更高的活性氧和脂質氧化標志物水平，肺癌組織中普遍高表達鐵蛋白，并使血清鐵蛋白水平升高[12]，此外，鐵死亡誘導能夠增強放療及化療的敏感性[13-16]，也進一步說明鐵死亡與肺癌關系密切。

麥冬具有滋陰潤肺、養陰生津的功效，以麥冬為主藥的抗癌方劑如沙參麥冬湯、麥門冬湯等在肺癌的臨床治療中發揮著重要作用，能提高患者免疫水平，提高放化療的敏感性，降低放化療的副作用[17-19]。麥冬也是一味抗癌中藥，通過多種途徑發揮抗癌作用，麥冬中的皂苷D、黃酮類化合物可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，導致A549細胞自噬[20-21]。

GSH是細胞內重要的抗氧化劑，是GPX4重要的合成底物，GPX4通過減少鐵依賴的脂質過氧化物轉變為高活性的脂質自由基，減少ROS的積累而抑制鐵死亡[22]。GSH與鐵死亡呈負相關，常用來衡量鐵死亡的水平。本研究中，麥冬乙醇提取物顯著抑制GSH的水平，提示麥冬乙醇提取物可能促進A549細胞鐵死亡。

為了探究麥冬乙醇提取物對A549細胞活性的抑制作用與鐵死亡的相關性，本文檢測了鐵死亡相關因子COX2、FACL4、FTH1的表達。COX2是一種鐵死亡敏感蛋白，在鐵死亡發生時被顯著上調。本研究發現，在麥冬乙醇提取物作用下，COX2表達增多。FACL4是脂肪酸代謝的第一步，在體內催化合成脂酰CoA，將長鏈多不飽和脂肪酸活化，以參加膜磷脂的合成，但是這些膜上的長鏈不飽和脂肪酸常被氧化，從而誘發鐵死亡[23]。FACL4表達與細胞鐵死亡敏感性正相關[24]，可通過增加多不飽和脂肪酸比例，降低脂質氧化耐受性，易化鐵死亡[25]。在本研究中，麥冬乙醇提取物作用下，FACL4表達增多。鐵蛋白是位于細胞質、細胞核和線粒體中的主要細胞內儲鐵蛋白，在鐵代謝中起主要作用[26]。鐵蛋白是一種24個亞基的球形和空心蛋白質復合物，細胞質鐵蛋白由兩種不同類型的亞基組成：19 kDa堿性 FLC 亞基和21 kDa酸性FHC亞基。FHC具有亞鐵氧化酶活性，可特異性地將二價鐵 (Fe2+)氧化為三價鐵 (Fe3+)[27-28]。發生鐵死亡的細胞中，鐵蛋白重鏈FHC表達升高[29]。在本研究中，麥冬乙醇提取物能夠促進A549細胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表達，促進A549細胞鐵死亡。

不僅是鐵死亡，脂質過氧化在細胞凋亡中同樣起著重要作用。脂質過氧化產物與膜受體和轉錄因子相互作用可以刺激內在和外在的凋亡信號通路，從而誘導細胞凋亡[30]。細胞內GSH濃度降低是線粒體凋亡信號傳導、氧化應激等誘導的凋亡級聯反應的早期事件[31]，GSH耗竭是由包括細胞毒性藥物刺激、壓力及環境因素等引發的凋亡性細胞死亡的共同特征[32]。本研究中，麥冬乙醇提取物能明顯增加A549細胞的凋亡程度，可能與抑制GSH相關。

此外，為了研究麥冬乙醇提取物促進A549細胞鐵死亡的具體機制，本研究檢測了Keap1、Nrf2分子的表達。Nrf2主要調節細胞抗氧化反應、氧化還原穩態和代謝平衡，是重要的氧化還原敏感性轉錄因子，Nrf2泛素化后易位至細胞核，通過與sMAF蛋白的異二聚化作用結合到靶基因的ARE/EpRE(抗氧化反應元件/親電響應元件)，誘導一系列細胞保護性基因表達，如NQO1、GST、HMOX1、GCL、GSH，抑制細胞鐵攝取、限制 ROS 產生，是鐵死亡的重要抑制劑[33]。Keap1是Nrf2上游的重要的負調節因子[34]，有研究證實，P62能夠通過Keap1促進Nrf2的激活，從而抑制肝癌細胞 HCC鐵死亡[35]。在本研究中可以觀察到，麥冬乙醇提取物能顯著抑制A549細胞活性，抑制強度與藥物濃度成正比，同時，麥冬乙醇提取物能顯著提高A549細胞凋亡水平。進一步研究發現，麥冬乙醇提取物能夠在基因和蛋白水平抑制A549細胞Keap1、Nrf2的表達，兩者作為鐵死亡的通路抑制分子，能抑制鐵死亡，提示麥冬乙醇提取物促進細胞鐵死亡作用可能與Keap1/Nrf2通路相關。

綜上所述，麥冬乙醇提取物可通過抑制A549細胞GSH水平，促進A549細胞鐵死亡相關分子的表達，促進細胞凋亡，從而抑制A549細胞活性，其作用機制可能與抑制Keap1/Nrf2途徑有關。后期我們將運用鐵死亡抑制劑及Nrf2抑制劑進一步實驗，以求它們之間的相關性；同時在體內進行驗證對比麥冬乙醇提取物的療效；最后，將通過藥物質譜分析進一步篩選麥冬乙醇提取物中發揮主要作用的有效成分并進行驗證，為肺癌的中醫藥治療提供了新的靶點和理論依據，為其臨床應用提供理論支持。