巴豆葉對腦缺血再灌注模型大鼠海馬CA3/DG區ERK5通路的影響*

潘佐泱，賈孟輝，，牛穎，賈戌生，馬玉瑋，李占濤，劉倩，岳云

1.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004； 2.銀川市第一人民醫院，寧夏 銀川 750001；3.三原縣醫院，陜西 三元 713800； 4.寧夏回族自治區海原縣中醫醫院，寧夏 海源 755299

缺血性腦血管病(ischemic ceebral vascular disease，ICVD)是最常見的腦血管疾病，占所有腦血管疾病的70%[1]，具有發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高、治愈率低的臨床特點。近年來，ICVD相關患者數量持續高增長[2]，成為一個緊急的醫療和社會問題。再灌注是ICVD最主要的治療手段之一，但會導致腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[3]。研究表明，海馬神經元細胞凋亡是造成CIRI后神經元損傷的關鍵因素[4]，抗凋亡蛋白可能是神經保護劑的潛在靶點。細胞凋亡可被絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路的胞外信號調節激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)調控，ERK5也稱為大MAPK，是最近發現的MAPK家族成員[5]。巴豆葉出自《南寧市藥物志》，為云南省哈尼族的慣用藥[6]。傣族名方“雅麻哈比扎哈聾”中用三種巴豆葉(毛葉巴豆葉、關葉巴豆葉、巴豆葉)治療中風偏癱、頭痛等[7]，且巴豆葉為其常用的單味藥物。研究顯示，巴豆葉提取物可降低細胞氧化損傷，還可通過抑制炎癥反應和氧化應激，減輕腦細胞損傷，從而保護神經細胞免受缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)的傷害[8]。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)模型，以尼莫地平[9]為陽性對照藥物，通過考察巴豆葉對大鼠腦組織ERK5信號通路蛋白的影響探討其對CIRI的腦保護作用及相關機制，以期為CIRI的預防和治療提供新型藥物。

1 材料

1.1 動物SPF級3～4月齡SD雄性大鼠216只，體質量(230±20) g，由寧夏醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(寧)2019-0001。所有大鼠飼養在溫度(25±1) ℃及濕度(50±10)%的動物房內，光暗周期12 h/12 h，自由進食和飲水，適應性飼養7天后進行實驗。

1.2 藥物與試劑巴豆葉(寧夏醫科大學第二附屬醫院藥劑科)；尼莫地平片(拜耳醫藥保健有限公司，規格：30 mg×20片，批號：H20203010)。RIPA裂解液(北京索來寶科技有限公司，貨號：R0020)；ECL發光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、伊紅染色液、DAB顯色液、EDTA抗原修復液(10X)、PBS、Mayor′蘇木素染色液、分化液(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：sc-2048、ZB-2301、ZB-2305、ZLI-9613、PV-8000、GL1100、P5368-10PAK、ZLI-9620、YY16041)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號：IPVH00010)；二甲苯、無水乙醇、95%乙醇(天津市永大化學試劑有限公司，貨號：M003921、HB15-AR-01KG、H380970)；TUNEL試劑盒(瑞士羅氏公司，批號：C1091)；中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10004160)；兔抗ERK5抗體(上海澤葉生物科技有限公司，批號：74f0374)；兔抗p-ERK5抗體(上海澤葉生物科技有限公司，貨號：AF8146)；水合氯醛(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200414)。

1.3 儀器BP310P型稱量天平(德國Sartorius公司)；centrifuge 5417R型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司，離心半徑：8.62 cm)；MDF-U72V型超低溫冰箱(日本SANYO公司)；THM#50132369型超純水儀(北京康銘泰克科技發展有限公司)；DS-11 型核酸蛋白定量儀(美國丹諾爾Denovix公司)；DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；WSE-4040型半干轉膜儀系統(ATTO公司)；TS-8型轉移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；3122000.060型移液器(德國Eppendorf公司)；V19型掃描儀(日本EPSON 公司)；科迪KD-TK 攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；SW.TFG-15型生物安全柜(廣州瑞智凈化設備有限公司)；CX31型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RM2245型切片機、LEICAEEG1150C型自動包埋機(德國LEICA公司)；PHY-3型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備分別精密稱取巴豆葉6 g、12 g、18 g，按傳統煎煮法[10]煎煮，巴豆葉切碎，置于煎器中，加蒸餾水浸沒藥材，浸泡1 h時后，保持微沸一定時間，分離煎出液。將藥渣依法煎出數次(一般為2～3次)，合并藥液，并濃縮至100 mL，濃度分別為0.06 g·mL-1、0.12 g·mL-1、0.18 g·mL-1，即為巴豆葉低、中、高劑量，將所得濃縮藥液按組標記好后4 ℃保存。將尼莫地平片研末，生理鹽水配制為濃度1.08 g·L-1的溶液。

2.2 大鼠分組、造模及藥物干預按隨機數字表法將216只大鼠分為假手術組、模型組、尼莫地平組及巴豆葉高、中、低劑量組，假手術組大鼠頸動脈分離后清創縫合即可，不行插線結扎操作，其余組大鼠采用Longa線栓法[11]制備大鼠MACO模型，具體方法如下：大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，仰臥固定，消毒，沿頸中線剪開皮膚約2 cm，鈍性分離筋膜及肌肉組織，剝離左側頸總、頸外及頸內動脈，在頸總動脈靠近三者分叉5 mm處剪一缺口，插線約16～18 mm，結扎固定，縫合，清創。自插線完成即刻計時，缺血2 h后，拔線至有阻力，剪去外露部分，清創縫合，消毒。造模過程中保證大鼠置于干凈恒溫的籠盒，隨時監測其生命體征，蘇醒后單獨飼養觀察。造模完成的大鼠采用Zea Longa評分法[12]對模型成功與否進行 評判，其中1～3分予以納入，0分及4分予以剔除。在進行腦缺血再灌注模型制備前30 min，各組大鼠分別給予1次相應藥物灌胃，其中，假手術組及模型組以同等體積的蒸餾水灌胃。造模完成后，分別于每天同一時間點進行灌胃，灌胃體積為10 mL·kg-1，每天2次，連續灌胃6 d。

2.3 神經功能評分給藥1 d、3 d、7 d后，每組取12只大鼠，采用Garcia JH評分法[13]對大鼠神經功能進行評分并記錄，總分為18分。每組SD大鼠的評分結果均為六項測試分數的總和，除假手術組外，大鼠神經功能評分加和超過15分的予以剔除，使其神經功能評分控制在3～15分，且評分越高，神經功能恢復程度越好，反之則越差。

2.4 HE染色觀察神經元細胞形態蘇木精-伊紅染色法涂染切片，電鏡下觀察細胞形態。給藥 1 d、3 d、7 d后，每組取12只大鼠，麻醉后固定大鼠，暴露胸腔，裸露心臟，于心尖迅速插入灌注針約1～2 μm，入左心室內后固定針頭，剪開右心耳，以最大流速進行生理鹽水灌注，同時觀察大鼠肝、肺臟器逐漸變白，直至右心耳流出澄清液體，立即更換4%多聚甲醛持續灌注，觀察大鼠四肢從劇烈抽動直至僵硬、且尾巴呈崩直狀態時結束灌注，分離顱骨，剖取色白質韌的全腦組織。對大鼠腦組織進行石蠟包埋、切片(厚5 μm)，經二甲苯脫蠟后，按100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精至水進行洗脫；蘇木素染液染色1～2 min；用分化液分化數秒后水洗；返藍液返藍至細胞核呈藍色后水洗；伊紅染色液染色10 min后進行水洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，拍照，存檔。

2.5 TUNEL檢測細胞凋亡情況給藥1 d、3 d、7 d 后，每組取12只大鼠，麻醉后取腦組織。取腦組織切片(厚約5 μm)，65 ℃烤片4.5 h；二甲苯脫蠟，梯度(100%、95%、90%、80%、70%)乙醇洗脫至水；Proteinase K工作液32 ℃反應20 min；PBS漂洗2次，每次5 min；待玻片干后，加50 μL TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液)于切片上，加封口膜在黑暗濕盒中37 ℃反應1 h；加50 μL converter-POD于標本上，加封口膜在黑暗濕盒中37 ℃反應30 min；滴加100 μL DAB顯色液，反應1 min，顯微鏡觀察至有陽性顯色立即終止；蘇木素復染5 s后立即水洗；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，運用光學顯微鏡(10×40)觀察大鼠海馬組織CA3/DG區細胞凋亡情況并拍照記錄。

2.6 免疫組化法檢測腦組織ERK5蛋白表達情況給藥1 d、3 d、7 d后，每組取12只大鼠，麻醉后取腦組織。取腦組織石蠟切片，常規脫蠟至水；將切片置于乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)抗原修復液，微波爐加熱至沸騰，室溫冷卻5 min后，加熱3 min，自然冷卻至室溫；滴加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加ERK5 一抗(稀釋比例為1：50)，4 ℃孵育過夜。37 ℃復溫30 min后，滴加生物素標記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例為1：50)，37 ℃ 孵育30 min；滴加鏈霉卵白素+辣根酶標記生物素，37 ℃ 孵育30 min，PBS清洗3次，每次 5 min；滴加DAB顯色液工作液，顯微鏡下觀察以控制反應時間，水洗后滴加Mayor′蘇木素復染，室溫孵育 2 min，水洗；中性樹膠封片后采用顯微鏡(10×40)觀察ERK5蛋白陽性表達情況并拍照記錄。

2.7 Western Blot檢測海馬組織ERK5、p-ERK5、p-ERK5/ERK5蛋白表達水平給藥1 d、3 d、7 d后，每組取12只大鼠，麻醉后取腦組織，置于冰上迅速剝離海馬組織。取海馬組織加入300 μL RIPA裂解液，充分混勻，4 ℃裂解2 h，12 000 r·min-1離心10 min，取上清備用；測定蛋白濃度；10% SDS-PAGE 電泳分離；轉于 PVDF 膜上，轉膜 35 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入ERK5、p-ERK5、β-actin一抗(稀釋比例為1：1 000)，4 ℃反應過夜；室溫復溫后，加入二抗(稀釋比例為1：3 000)，室溫孵育90 min；PBS 清洗曝光，以 β-actin為內參，用Image J軟件掃描作條帶灰度值分析，對海馬組織相關蛋白相對表達水平定量分析。

2.8 統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析。實驗數據采用兩因素多水平析因設計資料的方差分析。數據需符合隨機、正態性、方差齊的條件，若數據滿足總體方差齊性，采用雙向分組方差分析；若不滿足，則進行數據變換后，再次進行方差分析，仍用雙向分組方差分析；組間多重比較時，使用SNK-q檢驗進行組間的兩兩比較。

3 結果

3.1 各組大鼠神經功能評分比較在相同給藥時間下，與假手術組比較，模型組和各干預組大鼠神經功能評分顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各干預組大鼠神經功能評分均顯著升高(P<0.01)；與巴豆葉低劑量組比較，巴豆葉中、高劑量組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.01)；與巴豆葉中劑量組比較，巴豆葉高劑量組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.01)。除假手術組外，各組大鼠評分均隨著干預時間顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較 分)

3.2 HE染色結果模型組大鼠神經細胞均出現不同程度的核固縮、核體不規則、細胞間隙增大、間質水腫、核質排列不清等細胞損傷；各藥物治療組均能不同程度的修復神經細胞損傷，且隨著巴豆葉濃度的增加，干預時間的延長，大鼠腦組織神經元細胞形態改善越明顯，尤以巴豆葉高劑量干預7 d的效果最明顯。見圖1。

注：A：假手術組；B：模型組；C：巴豆葉低劑量組；D：巴豆葉中劑量組；E：巴豆葉高劑量組；F：尼莫地平組圖1 HE染色觀察各組大鼠腦組織缺血側病理形態學改變(×400)

3.3 TUNEL檢測結果在相同給藥時間下，與假手術組比較，模型組及各干預組大鼠海馬CA3/DG區凋亡細胞計數均顯著增加 (P<0.01)；與模型組比較，各干預組大鼠凋亡細胞計數均顯著降低(P<0.01)；與巴豆葉低劑量組比較，巴豆葉中、高劑量組大鼠凋亡細胞計數顯著降低(P<0.01)；與巴豆葉中劑量組比較，巴豆葉高劑量組大鼠凋亡細胞計數顯著降低(P<0.01)；除假手術組外，模型組及各干預組凋亡細胞計數均隨著干預時間延長顯著降低 (P<0.01)。見表2、圖2。

表2 大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬CA3/DG區 TUNEL陽性細胞計數比較

注：A：假手術組；B：模型組；C：巴豆葉低劑量組；D：巴豆葉中劑量組；E：巴豆葉高劑量組；F：尼莫地平組；圖2 TUNEL檢測各組大鼠海馬CA3/DG區細胞凋亡計數(×400)

3.4 Western Blot檢測結果在相同給藥時間下，與假手術組比較，其余各組大鼠海馬CA3/DG區ERK5、p-ERK5蛋白表達均顯著上調(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預組ERK5、p-ERK5蛋白表達進一步顯著上調(P<0.01)；與巴豆葉低劑量組比較，巴豆葉中、高劑量組ERK5、p-ERK5蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與巴豆葉中劑量組比較，巴豆葉高劑量組ERK5、p-ERK5蛋白表達顯著上調 (P<0.01)；除假手術組外，各組ERK5、p-ERK5蛋白表達在第1天至第3天呈上調趨勢，第3天至第7天呈下調趨勢，且差異有統計學意義(P<0.01)。見表3、圖3。

注：A：假手術組；B：模型組；C：巴豆葉中劑量組；D：巴豆葉低劑量組；E：尼莫地平組；F組：巴豆葉高劑量組圖3 WB 檢測各組大鼠海馬CA3/DG區ERK5及p-ERK5蛋白條帶圖

表3 WB 檢測各組大鼠海馬CA3/DG區p-ERK5/ERK5表達量

3.5 免疫組化檢測結果在相同給藥時間下，與假手術組比較，其余各組大鼠ERK5陽性細胞計數均顯著上調(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預組ERK5陽性細胞計數進一步顯著上調(P<0.01)；與巴豆葉低劑量組比較，巴豆葉中、高劑量組大鼠ERK5陽性細胞計數顯著上調(P<0.01)；與巴豆葉中劑量組比較，巴豆葉高劑量組大鼠ERK5陽性細胞計數顯著上調 (P<0.01)；除假手術組外，其余各組ERK5陽性細胞計數在第1天至第3天呈上升趨勢，第3天至第7天逐漸下降 (P<0.01)，且第1天ERK5蛋白主要在胞膜及胞核膜上表達，第3天主要出現在細胞核中，而在胞漿中逐漸減少，差異均具有統計學意義(P<0.01)。見表4、圖4。

表4 免疫組化檢測各組大鼠海馬CA3/DG區ERK5陽性細胞計數

注：A：假手術組；B：模型組；C：巴豆葉低劑量組；D：巴豆葉中劑量組；E：巴豆葉高劑量組；F：尼莫地平組圖4 免疫組化檢測各組大鼠海馬CA3/DG區 ERK5陽性細胞計數(×400)

4 討論

研究發現，腦缺血損傷會逐漸向鄰近細胞擴散，形成以凋亡為主要病理因素的缺血半暗區[14]，而半暗區組織損傷發展較慢，凋亡也具有高度可控性，及時恢復血流，搶救半暗帶神經細胞凋亡是目前最有效的手段[15-16]。有充分的證據表明，信號分子在減輕腦IR損傷方面發揮著重要作用，特別是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)[17]。研究表明，MAPKs由四個高度保守的亞家族組成，包括ERK1/2、Jun-NH2末端激酶1/2 (c-Jun NH2-terminal kinase1/2，JNK1/2)、p38 MAPK、ERK5。其中，ERK5是近年來研究較少、相對較新的一條通路，其發揮作用遵循 MAPKs 的蛋白激酶反應鏈[18]，由Ras 作為上游激活蛋白，依次激活Raf(MAPK 激酶的激酶，MAPKKK)、MEK(MAPK 激酶，MAP-KK)和ERK(MAPK)，即Ras-Raf-MEK-ERK途徑[19]。ERK5是細胞存活的關鍵因素，研究表明，缺血半暗區ERK5、p-ERK5激酶的上調在減少神經元細胞凋亡中起關鍵作用，有助于神經元保護[20]。實驗顯示，顯著抑制ERK5核易位不僅能顯著降低缺血后海馬CA3/DG區ERK5的激活和蛋白表達水平，而且顯著增加了缺血3 d后海馬CA3/DG區ERK5的死亡[21]，此研究可能為CIRI后ERK5通路激活提高CA3/DG區缺血腦組織的存活提供了直接證據。

巴豆葉是大戟科植物巴豆的葉片，《中華本草》[22]及《中華人民共和國藥典》[23]中均有記述，巴豆葉辛、溫，有毒，歸三焦、大腸經，一般隨采隨用，或采后曬干用，具有祛風活血、殺蟲解毒的作用，可用于治療瘧疾、痹證、跌打損傷、纏腰火丹、瘡癬等，常研末酒沖，或膠囊裝，每次0.03～0.15 g，外用適量，煎水洗，或浸酒搽，用治凍瘡，并可殺孑孓、蠅蛆，現代主要用于治療跌打腫痛、腰肌勞損、偏癱頭痛等[24]。研究發現，巴豆葉所含的主要化合物及大量人體必需微量金屬元素具有抗氧化[25]、鎮痛[26]、抗炎[27]及調節血壓、血糖、血脂的作用[28]。而高血壓不僅僅是一種疾病，也是卒中和心肌梗死等心血管疾病最為常見的危險發病因素，有研究證實，舒張壓每升高5 mm Hg，卒中病發風險可增加35%～40%[29]。佛波醇酯是巴豆葉中最主要的二萜類化合物[30]，其結構類似于蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的生理激活劑，可以結合 PKC 的功能區，在調節細胞分裂、增殖、凋亡、炎癥發生及離子通道等方面有著至關重要的生理效應[31]，這也與巴豆葉解痙止痛、祛風活血而用于頭痛發熱、胸悶協痛等的古記載相關聯。由此可見，采用巴豆葉入藥無疑對 CIRI 的防治具有深遠意義。

本研究首次采用線栓法制備大鼠MACO模型評價中藥巴豆葉對CIRI的保護作用，巴豆葉毒性實驗結果表明，連續1周以600～1 800 mg·kg-1濃度灌胃的大鼠未出現死亡、行為異常或中毒癥狀，說明巴豆葉在此濃度范圍內對大鼠無毒性作用，其近似致死濃度超過1 800 mg·kg-1。本研究結果發現，模型組大鼠出現精神萎靡、神經功能嚴重缺損癥狀，表現為進食狀況差，舌體紫暗，形體消瘦，被毛臟亂干結，活動遲緩，反應遲鈍，對側肢體無力，甚向對側旋轉或傾倒等癥狀，也可見 Honer′s 征；其腦組織病理學形態表現為神經元結構松散、排列紊亂、輪廓不完整；同時海馬CA3/DG區神經元細胞大量死亡，神經元密度顯著降低，出現胞核萎縮、染色質分割成塊或邊緣化的細胞形態；但7 d后，模型大鼠神經功能損傷癥狀有輕度減輕的現象，表明CIRI后，機體具有一定的自愈能力，這可能與CIRI后ERK5通路被激活有關。巴豆葉提取物干預后，上述指標均隨著干預濃度和時間的增加出現明顯好轉，表現為進食增加，舌體轉為暗紅，形體逐漸勻稱，被毛整潔有光澤，活動及靈敏度提高；神經元結構相對緊密、排列較整齊、輪廓基本完整，核仁清晰，受損神經元數量明顯減少；同時海馬CA3/DG區神經元密度顯著升高。對ERK5通路研究發現，CIRI 24 h后，ERK5可被持續激活，而巴豆葉干預可進一步激活ERK5蛋白激酶，尤以巴豆葉高劑量干預7 d效果顯著，可能因該組藥物所含有效成分較高且作用時間較長，兩因素疊加使得作用效果最佳。ERK5的磷酸化首先在細胞漿中顯著增強，至再灌注3 d后，主要出現于細胞核中，而在胞漿中逐漸減少，且胞核中ERK5蛋白磷酸化水平逐漸增加；同時ERK5蛋白表達先下降，再上升，最后逐漸下降至接近假手術組，這可能與經典的MAPK級聯反應對MKK5/ERK5通路的負反饋作用有關[32]。因絕大多數ERK5位于靜息細胞的胞漿中，故ERK5的部分活化和易位并沒有顯著影響胞漿中ERK5的總蛋白水平。本研究的結果與其他作者的相關研究[14，21，33]結果對應。

綜上所述，ERK5通路的激活可能促進缺血再灌注后海馬CA3/DG區神經元的存活，從而對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用；巴豆葉能進一步激活ERK5蛋白激酶，顯著上調通路蛋白，有效改善大鼠再灌注后的神經功能缺損癥狀、修復神經元細胞損傷、減少海馬CA3/DG區神經元凋亡，且效應與作用濃度和時間均成正比，這可能與巴豆葉參與調控ERK5通路的進一步激活，從而介導促進神經元細胞增殖分化，抑制海馬CA3/DG區細胞凋亡的神經保護機制有關。本研究結果揭示了巴豆葉對CIRI海馬CA3/DG區缺血腦組織潛在的神經保護作用，但其具體作用機制還有待于進一步的深入研究考證。