新風膠囊通過調節Notch1通路、巨噬細胞極化改善類風濕關節炎大鼠關節炎癥*

趙磊，萬磊，劉健，黃傳兵，馬熙檬，朱子衡，李舒，李方澤，葛瑤，劉天陽，劉磊，李明

1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種復雜的慢性炎癥性自身免疫性疾病，常累及小關節，病變呈對稱性、侵襲性和致殘性，其特征是明顯的滑膜增生和關節滑膜炎，是炎癥細胞因子顯著過度生產導致骨和軟骨破壞的結果[1-2]。RA患者的滑膜中存在著大量巨噬細胞，參與RA炎性反應的多個階段和環節，在RA發生發展過程中發揮著重要的作用，與RA疾病活動密切相關。巨噬細胞極化可分泌大量促炎性細胞因子、趨化因子，激活成纖維細胞和破骨細胞，加速機體炎癥反應，造成關節破壞[3-4]。Notch信號通路出現在大多數生物中，參與調節分化、增殖、黏附、凋亡等各種細胞過程，在包括免疫反應、炎癥性疾病等在內的疾病中起著關鍵作用[5-6]。研究表明，Notch1在滑膜組織和活化的巨噬細胞中過表達[7]。

中醫藥通過整體調節作用在治療RA時發揮療效好、價格便宜、副作用少等優點，廣泛應用于臨床。新風膠囊為新安醫家劉健教授據多年臨床經驗所創，由雷公藤、黃芪、薏苡仁、蜈蚣配伍組成，具有健脾化濕通絡之功效。前期臨床及動物實驗表明，新風膠囊能明顯改善RA患者關節腫脹、晨僵、滑膜炎癥反應等，降低關節炎大鼠炎癥反應，調節炎癥極化狀態，還可通過調節Notch信號轉導通路下調Notch1、Hes1蛋白的表達，降低致炎介質轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，從而抑制炎癥反應，延緩RA發病進程[8-9]。本研究通過考察新風膠囊對RA大鼠關節炎癥的影響探討其治療RA的作用機制。

1 材料

1.1 動物清潔級雄性SD大鼠32只，體質量 (190±20) g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：Lscxk (皖) 2017-001。標準清潔級動物房飼養，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%，保持通風排氣10～20次·h-1。本實驗通過安徽中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會的批準，動物倫理編號：AHUCM-rats-2021022。

1.2 藥物與試劑新風膠囊(安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，批號：191015)；甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：191213)。弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，貨號MB9887)；白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-10、IL-23、TGF-β 試劑盒(武漢基因美公司，貨號：JYM0419Ra、JYM0651Ra、JYM0297Ra、JYM0636Ra)；CD68-FITC、CD80-PE、CD163-AF647、兔Notch1抗體(美國santa cruz生物技術公司，貨號：SC-20060FITC、SC-18866 PE、SC-20066 AF647、SC-32745)；兔Hes1抗體(美國abcam公司，貨號：ab108937)。

1.3 儀器流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：navios)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CKX31)；離心機(上海和欣科教設備有限公司，型號：80-2)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥按照隨機對照表將32只大鼠隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組和新風膠囊組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑(每只0.1 mL)以致炎，構建類風濕關節炎大鼠模型[10-11]。致炎后第12天開始給藥，將新風膠囊粉末溶于0.9%氯化鈉溶液制成0.34 g·L-1混懸液；甲氨蝶呤研成細粉后，將細末溶于0.9%氯化鈉溶液制成0.95 mg·L-1混懸液。按10 mL·kg-1灌胃給藥，新風膠囊組每天1次，甲氨蝶呤組每周1次，正常組及模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1灌胃，每天1次，給藥周期30 d。

2.2 大鼠足跖腫脹度、關節炎指數的測定給藥后30 d測量各組大鼠足跖腫脹度、關節炎指數[12]。足跖腫脹度=(造模后足趾容積-造模前足趾容積)/造模前足趾容積。關節炎病變指數按5級評分法評價，無紅腫現象為0分，小趾關節出現紅腫為1分，趾關節和足跖出現腫脹為2分，踝關節以下的足爪發生腫脹為3分，包括踝關節在內的全部足爪發生腫脹為4分。

2.3 關節病理學觀察各組大鼠取右后足遠端趾間關節，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，切片(修、切、展、貼、烤片)，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察大鼠關節滑膜及軟骨組織病理形態變化。

2.4 流式細胞術檢測大鼠外周血炎癥極化標志物CD80+細胞、CD163+細胞的表達取大鼠新鮮血液100 μL，按1×106個細胞/管分別加入 CD80-PE、CD163-AF647抗體。按照說明書操作，采用EPICS型流式細胞儀檢測。用flowJoV10軟件對流式細胞圖像進行分析，統計CD80+細胞、CD163+細胞與淋巴細胞比值作為M1、M2型巨噬細胞相對表達量。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清細胞因子IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的表達腹主動脈采血，離心取上清液，依照ELISA試劑盒說明操作檢測IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的OD值，繪制IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β標準曲線，測算出大鼠血清 IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β濃度。

2.6 Western Blot檢測Notch1、Hes1蛋白表達水平用蛋白提取試劑盒提取滑膜總蛋白，電泳分離，采用半干法轉膜使蛋白質從膠轉移至膜上，用室溫5%的脫脂奶粉封閉膜2 h。免疫反應：將Notch1、Hes1抗體1：2 000稀釋后和膜一起室溫下孵育 2 h，加入二抗(稀釋比例為1：8 000)室溫孵育1 h。采用增強化學發光法顯色并拍照。計算各組Notch1、Hes1條帶的灰度值，以目的條帶與內參β-actin灰度值的比值做為滑膜Notch1、Hes1蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 新風膠囊對RA大鼠關節炎癥的影響與正常組比較，模型組RA大鼠足趾腫脹度、關節炎指數顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，新風膠囊組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠足跖腫脹度、關節炎指數比較

3.2 新風膠囊對關節滑膜病理變化的影響HE染色顯示，正常組大鼠關節滑膜組織結構清晰，滑膜無肥大、突起，無炎性細胞浸潤，滑膜細胞分界清楚，分層較少；模型組大鼠關節滑膜可見大量炎性細胞浸潤，多為嗜酸性細胞和中性粒細胞，滑膜血管增多，血管壁及其周圍附屬組織可見大量炎性細胞浸潤，滑膜襯細胞分層增多；新風膠囊組大鼠的關節結構較為完整，滑膜細胞排列比較整齊，關節滑膜、血管壁出現少量炎性細胞浸潤，關節面整體結構較為規整；甲氨蝶呤組大鼠關節面滑膜細胞排列較整齊，關節面較模糊，部分關節軟骨處可見血管翳形成。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠足趾關節病理形態學變化(×200)

3.3 新風膠囊對RA大鼠M1、M2表面標志物的影響與正常組比較，模型組RA大鼠CD80+細胞表達明顯升高(P<0.01)，CD163+細胞表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，新風膠囊組CD80+細胞表達明顯降低(P<0.01)，CD163+細胞表達明顯升高(P<0.05)。見表2，圖2，圖3。

圖2 大鼠外周血M1巨噬細胞標記物CD80+細胞表達

圖3 大鼠外周血M2巨噬細胞標記物CD163+細胞表達

表2 各組大鼠M1、M2表面標志物的比較

3.4 新風膠囊對RA大鼠IL-1、IL-23、IL-10、 TGF-β水平的影響與正常組比較，模型組大鼠IL-1、IL-23、TGF-β表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IL-10表達水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，新風膠囊組IL-1、IL-23、TGF-β表達水平明顯降低(P<0.05)，IL-10表達水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1、IL-23、IL-10及TGF-β水平比較

3.5 新風膠囊對RA大鼠關節滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白的影響與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，新風膠囊組滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 各組大鼠Notch1、Hes1蛋白表達水平比較

圖4 Notch1、Hes1蛋白條帶圖

4 討論

RA是一種自身免疫性炎癥性關節疾病，可通過巨噬細胞浸潤、淋巴細胞聚集及滑膜成纖維細胞的過度增殖促進IL-1、IL-23等炎癥細胞因子的分泌，造成局部和全身性骨丟失，最終導致關節侵蝕和破壞[13-15]。IL-1是早期關節炎的重要觸發因子，RA患者血液和關節滑膜液中均可檢測到IL-1的表達升高。IL-1還可和TNF-α共刺激滑膜巨噬細胞的分化，促進破骨細胞形成，從而導致RA滑膜、軟骨的破壞[16-17]。IL-23能夠通過激活細胞核轉錄因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保護素(osteoprotegerin，OPG)系統促進破骨細胞形成，導致過度骨吸收，加速RA骨丟失[18-19]。

RA 屬于中醫“痹證”范疇，多呈現“脾虛濕盛、痰瘀膠著”的證候學特征。針對RA病機特征，具有健脾益氣、化濕通絡功效的中藥新風膠囊被創制，且臨床療效確切[20-21]。君藥黃芪、薏苡仁及其單體有效成分能抑制促炎因子IL-1β的表達，提高抗炎因子IL-10水平，具有免疫調節、抗炎等多種生理功能，抑制大鼠滑膜細胞過度增殖，減輕炎癥反應[22-24]。臣藥雷公藤及蜈蚣對消除RA炎癥具有重要作用，現代藥理學研究表明，雷公藤甲素可通過降低RA成纖維樣滑膜細胞中miR-221及炎癥因子的表達來調節軟骨細胞的增殖和分泌，從而抑制炎癥并緩解RA癥狀[25]；蜈蚣提取物可通過減弱NF-κB信號通路的激活和抑制體內外促炎介質的產生來發揮抗炎癥的作用，從而達到控制病情進展的目的[26]。

在體內外不同環境因素的影響下，巨噬細胞可極化成M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞兩個亞群，M1巨噬細胞常見的標志物有CD80+細胞，可分泌大量促炎性細胞因子(如IL-1、IL-23、TGF-β)，激活成纖維細胞和破骨細胞，加速機體炎癥反應，造成關節破壞。M2巨噬細胞常見的標志物有CD163+細胞，通過大量產生抗炎細胞因子(主要是IL-10)，促進血管生成、組織重塑和修復[27]。在γ分泌蛋白酶的介導下，Notch受體(Notch1到Notch4)與配體(Delta1、Delta3、Delta4及Jagged1-2)相互作用，結合下游信號蛋白形成轉錄復合物，與轉錄因子結合，影響下游靶基因Hes1的表達，激活Notch信號通路，致巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞，促進炎癥細胞因子表達，加重RA炎癥反應[28-29]。研究表明，當Notch1通路被抑制時，巨噬細胞極化同時被抑制，炎性細胞因子的水平明顯降低，IL-10水平升高[6]。

本研究發現，經新風膠囊治療后，RA大鼠關節炎指數和足趾腫脹度癥狀得到顯著改善，M1型巨噬細胞表面標志物CD80+細胞及其炎性細胞因子 IL-1、IL-23等水平顯著降低，M2型巨噬細胞表面標志物CD163+細胞及其抗炎細胞因子IL-10等表達顯著升高，同時Notch1、Hes1的表達降低，說明新風膠囊能通過調節Notch1通路、巨噬細胞極化改善類風濕關節炎大鼠關節炎癥。

綜上所述，新風膠囊可能通過抑制Notch1通路、巨噬細胞極化，降低關節滑膜炎癥反應，抑制關節炎癥反應，改善RA關節炎癥。