蜂王漿中的Royalactin具有維持胚胎干細胞多能性和自我更新的作用

錢家樂 胡福良│編譯

浙江大學動物科學學院，杭州 310058

蜂王漿是哺育工蜂的咽下腺和上顎腺分泌的、用以飼喂蜂王和小幼蟲的漿狀物質。蜂王漿的化學組成復雜，生物學活性豐富而顯著，通常認為蜂王漿中的脂肪酸和王漿主蛋白是蜂王漿的主要活性成分。1992年，Hanes和Simuth首先發現蜂王漿中一種相對分子量為57kDa的蛋白質，將其命名為“王漿主蛋白”（MRJP）。至今，已經從意蜂王漿蛋白中提取分離出9種王漿主蛋白（MRJP1～MRJP9）。2001年，日本學者Masaki Kamakura等研究發現，小鼠肝細胞在王漿主蛋白1（MRJP1）影響下能保留不斷生長刺激和細胞增殖表型，于是又將MRJP1命名為Royalactin。雖然這些研究表明蜂王漿中的蛋白質對調節細胞狀態和命運有非常重要的功能性作用，但其作用機理尚不清楚。2018年12月4日，《Nature Communications》在線發表了美國斯坦福大學Kevin C. Wang團隊的研究結果，表明Royalactin具有維持胚胎干細胞多能性和自我更新的作用。有機體在Royalactin的幫助下能產生更多的干細胞來構建和修復自身，也就是說，它能使干細胞處于一種自我更新的狀態。

小鼠胚胎干細胞（mESCs）是從早期胚胎的內細胞團（ICM）或單卵裂球中分離培養得到的一類細胞，其主要特點是一方面有自我更新能力，另一方面具有分化成機體內所有其他細胞的潛能。雖然目前對于控制小鼠胚胎干細胞自我更新的各種信號通路的解析仍在繼續，但在體外培養條件下維持干細胞自我更新或促進其分化的方法已經十分成熟。在體外培養中，白細胞抑制因子（LIF）能與胚胎干細胞表面的一復合受體（低親和性的LIF受體和普通亞基gp130構成異源二聚體）結合并激活Jak酶，通過對STAT3的磷酸化激活維持細胞自我更新基因的表達。另有研究表明，在添加有LIF的無血清培養基中加入2種針對MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制劑（2i），能夠有效降低多能性因子的異質性表達，從而使胚胎干細胞處于類似內細胞團的自然基礎狀態，能在更加穩定的狀態維持其多能性和自我更新。然而，長期抑制Mek1/2的表達可能對小鼠胚胎干細胞的表觀遺傳和遺傳完整性有不利影響，并會明顯限制其發育潛能。由此，如何用新的方法進行體外培養胚胎干細胞并維持其處于內細胞團基態成為目前亟待解決的問題。

斯坦福大學Wang團隊證實了蜂王漿中的Royalactin可以在無LIF的情況下通過調節染色質的可及性來激活體外小鼠胚胎干細胞的多能基因網絡，并維持其自我更新。在Royalactin條件下培養的細胞也能維持在一個更加原始的狀態，并通過種系傳遞有能力產生嵌合體動物。同時，還證實了一種哺乳動物體內存在Royalactin的結構類似物也具有相似的功能，揭示了特定進化過程中的分子保守現象。其研究內容和結果主要包括以下4個方面：

一、Royalactin能有效維持mESCs的自我更新和多能性

Wang團隊以小鼠及其胚胎干細胞作為實驗對象，并主要通過小鼠胚胎干細胞模型研究Royalactin在哺乳動物中的作用機制。實驗首先通過將2種不同的mESCs（J1、R1）分別放在3種不同的培養基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培養10代、20代。結果表明，長期處于血清/+LIF培養基條件的mESCs經過培養后仍保持自我更新的形態，而在血清/-LIF培養基中培養的mESCs表現出分化后的形態。令人驚訝的是，在血清/-LIF+Royalactin培養基條件下培養的mESCs經過多代培養仍能在一定程度維持未分化的狀態，并且mESCs中未分化細胞的數量與培養基中Royalactin的劑量在一定范圍內呈正相關。細胞的基因表達譜也證實了在血清/-LIF+Royalactin和血清/+LIF培養下的細胞表現出高度的相似性。

在觀察到Royalactin在體外對mESCs有很好的干性維持效應后，他們接著對血清/-LIF+Royalactin條件培養下的mESCs能否在體內仍能維持胚胎特征和分化潛能進行了檢測。他們對該細胞進行皮下移植后培養6周，成功觀察到畸胎瘤的產生。上述研究結果表明，Royalactin能有效維持mESCs的自我更新和多能性。

二、Royalactin能調節染色質和多能網絡

Royalactin對mESCs轉錄組有怎樣的影響呢？Wang團隊對3種培養基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）中培養的mESCs進行了RNA-seq分析。結果表明，Royalactin條件下和LIF條件下的mESCs在標準多能基因的高度富集和系列特異性基因的抑制表達在多個水平都較為相似。由于Royalactin影響下的mESCs中有基因富集的情況，他們對該條件下的所有差異性表達的基因進行了GO term分析，結果表明Royalactin對mESCs的基因富集主要涉及細胞增殖和維持細胞干性等基因表達的上調。同樣地，他們分別對3種培養基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培養的mESCs進行了ATAC-seq分析，結果表明Royalactin與LIF條件下mESCs的ATAC-seq信號增幅相對于血清/-LIF條件更為相似，尤其是在啟動子、增強子和超級增強子水平。上述的RNA-seq與ATAC-seq的實驗結果高度相關，并且GO分析的功能注釋表明ATAC-seq主要落點于與多能性、代謝和分化相關基因。此外，motif富集分析顯示，Royalactin影響下的超級增強子組分上調引起了KLF5、KLF4和SOX2等轉錄因子與其結合位點的高頻結合。總的來說，這表明了調控序列對Royalactin條件敏感，并能因此調控下游基因的表達。

為了加深在分子水平對Royalactin條件下的小鼠胚胎干細胞基因表達模式的認識以及找尋可能的多能性調控因子，Wang團隊對Royalactin條件下的mESCs進行了轉錄組網絡分析，結果表明Stat3、Tfcp2l1、Esrrb以及Nanog等轉錄因子在轉錄網絡中是最重要的節點。后續的實驗表明，Royalactin對磷酸化Stat3以及其他多能因子的刺激有一定程度的劑量效應。另外，減少這些轉錄因子會極大程度地限制Royalactin對mESCs的作用。這一系列的發現說明了Royalactin能激活一條非LIF依賴性的信號通路，并且該通路能激活Stat3轉錄因子。對血清/+LIF和血清/-LIF+Royalactin條件下培養的mESCs進行基因表達譜分析顯示，有519個基因僅受Royalactin影響并上調。對這519個基因進行GO分析，結果表明這些基因主要富集于代謝和生物合成過程，這讓他們聯想到2種針對MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制劑（2i）存在條件下的無血清有LIF的2i培養基。于是他們對血清/-LIF+Royalactin、2i和血清/+LIF培養基條件下培養的mESCs分別進行了全基因表達譜分析和主成分分析。結果表明，相對于血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和2i條件下培養的mESCs聚類情況更為明顯。總之，上述結果表明Royalactin會維持mESCs的多能性，并以此猜測Royalactin可能會使mESCs處于自然基礎狀態。

三、Royalactin促使mESCs的多能性處于類自然基礎狀態

根據之前的猜想，Wang團隊對Royalactin是否能使mESCs的多能性處于自然基礎狀態進行了驗證。首先通過簡單的對照實驗證實了在2i+LIF和0i+Royalactin培養基中的mESCs的多能性保存效果良好，而0i培養基中的mESCs有明顯的分化現象。另外，將0i+Royalactin培養基培養的細胞注射進小鼠的囊胚中，產生的嵌合體后代性狀能進行種系傳遞，說明Royalactin在生物體內的影響是不損害其健康的。

RNA-seq和GO分析進一步說明了2i+LIF和0i+Royalactin培養基培養的mESCs所富集的基因有顯著相似性，對2i+LIF、0i+Royalactin、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和血清/-LIF培養基培養的mESCs進行全基因譜分析和主成分分析，結果證實了0i+Royalactin和2i+LIF條件下的細胞相比其他條件下的細胞聚類情況更加明顯。對上述條件下培養的細胞進行GO富集分析，發現在基礎代謝、轉錄過程以及發育等過程呈現差異。以上數據表明，Royalactin對mESCs的影響伴隨著深刻的代謝重編程，并且類似于2i+LIF條件，Royalactin能促使mESCs模擬小鼠內細胞團細胞環境，使其多能性處于類自然基礎狀態。

四、在哺乳動物體內找到Royalactin的類似物

Wang團隊想知道哺乳動物體內是否存在Royalactin的類似物。通過使用高靈敏的蛋白序列比對方法PSI-BLAST和HHPRED進行數據庫搜索并根據序列和結構比對人類和小鼠蛋白質。雖然在上述數據庫沒有找到Royalactin的直接同源蛋白，但HHpred在PDB數據庫中找到了Royalactin的“遠親”——一種沙蠅的唾液腺分泌的蛋白質（SGP）。于是他們以SGP作為模板，在同源建模軟件MODELLER中模擬Royalactin的折疊模式，構建了一個高可信度的模型，想憑借此模型重新用更為精準的HHpred在人蛋白質組中搜索，以期找尋該模型的結構功能類似物。最終他們找到唯一與模型相匹配的蛋白質，并將其臨時命名為NHL Repeat Containing 3（NHLRC3）。雖然之前對NHLRC3的功能并沒有過任何報道，但他們通過對小鼠胚胎進行單細胞RNA-seq分析，發現在4.5日齡胚胎中NHLRC3開始表達，并在此后逐漸提升其表達量。為證明它與Royalactin有相似的對mESCs的多能性有維持作用，他們將重組后的NHLRC3加入到血清/-LIF培養基中，制成血清/-LIF+NHLRC3（0i+NHLRC3）培養基。經過多代培養后，Royalactin和NHLRC3影響下的mESCs都處于未分化狀態。另外，將0i+NHLRC3條件下培養的小鼠胚胎干細胞注射進小鼠囊胚中，并將囊胚發育成能進行種系傳遞的嵌合體動物，說明NHLRC3在生物體內的影響是不損害其健康的。因此，NHLRC3被證實為哺乳動物多能性維持因子，它的存在也說明了大分子結構和功能的顯著保守性。由于其和Royalactin有相似的功能，并且在一定程度上可以說是蜂王漿成就了蜂王，因此他們將NHLRC3重新命名為Regina（拉丁語的女王）。

綜上，經過一系列的實驗探究，Wang團隊證實了Royalactin能維持小鼠胚胎干細胞的自我更新和多能性，并且可以促使其處于自然基礎狀態；在哺乳動物體內還找到了Royalactin的類似物Regina，同時也證實了Regina作為多能性因子也能促使小鼠胚胎干細胞處于自然基礎狀態。對于Royalactin和Regina在基因通路和進化中保守的生化過程之間交互作用的深刻認識，和不同的多能網絡功能是怎樣單獨或協同維持干細胞自我更新，將會使人類能更好地控制干細胞的命運，并能提供一個進一步研究多能狀態的平臺。對Regina的發現和探究也因此支持了一個有趣的觀點：即使是進化程度極高的特殊性狀也有著極深刻的分子保守性。對于Royalactin和Regina在哺乳動物細胞中機械性作用的深刻探究，將會對哺乳動物多能性有更深刻的理解。此外，Royalactin和Regina可以為因細胞死亡引起的疾病（如阿爾茨海默病、心臟衰竭和肌肉萎縮等）帶來新療法，在醫學應用領域有著更加深遠的意義。