韓楠 喬曉峰 朱曉文 倪健

(佳木斯大學附屬第一醫院 1.骨一科；2.普外科，黑龍江 佳木斯 154000)

骨關節炎(Osteoarthritis, OA)是最常見的一種關節炎，據估計全球約有2.4億人受到骨關節炎的影響[1]。老年人通常開始出現骨性關節炎癥狀，并伴隨這種慢性殘疾生活，嚴重影響生活質量。由于醫療保健和社會支出，骨關節炎的財政支出也給患者個人和保險公司帶來了沉重負擔[2]。因此，全面闡明骨關節炎疾病進程的分子機制對尋找新的治療方法具有重要意義。各種病理改變可導致骨關節炎癥狀，如關節軟骨和韌帶的退化、滑膜炎癥、骨贅形成或關節囊肥大。軟骨細胞是關節軟骨的主要常駐細胞，負責產生和維持軟骨基質，其失調是骨關節炎發病機制中最常見的相關因素之一[3]。細胞凋亡增加、細胞增殖能力減弱、軟骨細胞數量和活力降低以及軟骨細胞炎癥通常參與了骨關節炎的進展[4]。因此，充分了解軟骨細胞與細胞凋亡和炎癥相關的調控機制有助于尋求更有效的骨關節炎治療策略。microRNAs (miRNAs)是內源性 (21～23個核苷酸)的非編碼RNA，能夠通過與 mRNA序列的3′UTR區域互補配對控制靶mRNA的翻譯從而負向調控靶mRNA的表達[5]。miRNA的異常調控參與了多種疾病的發病機制，包括腫瘤發生、神經系統疾病和骨關節炎[6]。miR-200c-3p已被證明在骨關節炎樣本中低表達[7]，但其在骨關節炎中的具體功能和調控機制仍有待發掘。本研究旨在評估miR-200c-3p在骨關節炎進展中對軟骨細胞凋亡和炎癥反應的調節作用及其下游調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 膠原酶D(羅氏)，1%青霉素/鏈霉素(武漢益普生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000(美國英杰公司)，miR-200c-3p模擬物(上海吉瑪制藥技術有限公司)，脂多糖(上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司)，CO2恒溫細胞培養箱(上海朗喜工業科技有限公司)，miRNeasy Mini試劑盒(德國QIAGE公司)，miScript逆轉錄試劑盒(德國QIAGE公司)，C1磁珠(美國賽默飛世爾生物技術有限公司)，pmirGLO雙熒光素酶報告載體(上海吉凱基因醫學科技股份有限公司)，雙熒光素酶報告檢測系統(北京普洛麥格生物技術有限公司)，ELISA試劑盒(美國賽默飛世爾生物技術有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)，流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，酶標儀(美谷分子儀器上海有限公司)。

1.2 實驗動物及OA模型的建立 從中國科學院上海實驗動物中心獲得30只雄性小鼠C57BL/6 (8周,體重20～25 g)，在一個特定的實驗動物設施的無病原體的微隔離籠子里飼養，溫度為22～24℃，可自由獲得食物和水。小鼠隨機分為對照、Sham、OA組，每組10只。如前所述，通過破壞內側半月板的穩定性構建小鼠OA模型[8]。實驗所涉及的所有程序均經佳木斯大學附屬第一醫院批準。

1.3 小鼠軟骨細胞培養 小鼠原代關節軟骨細胞從膝關節組織中分離[9]。用頸椎脫位法對8周大的雄性小鼠實施處死，并小心地從脛骨平臺、股骨頭和股骨髁中取出關節軟骨組織，然后用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗。切斷關節軟骨，用膠原酶D (3 mg/mL)室溫下過夜不旋轉。過濾消化液，將細胞懸浮于Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養基中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素。將細胞放置于培養箱中培養(條件設置為5% CO2, 37℃)。細胞傳代2～3周，培養至70～80%合流。

1.4 細胞轉染 將軟骨細胞用100 ng/mL脂多糖(LPS)處理細胞6 h，誘導炎癥反應。將miR-200c-3p模擬物(miR-200c-3p mimics)和陰性對照(NC mimics)，以及pcDNA3.1/Zeb1和pcDNA3.1空載(對照組)分別添加到培養基中，使用LipofectamineTM3000轉染培養的軟骨細胞。48 h后，收獲細胞，用于后續實驗。

1.5 檢測方法

1.5.1 實時定量PCR法檢測基因表達 使用RNeasy和miRNeasy Mini試劑盒分離總RNA。用miScript逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR檢測試劑盒(Applied Biosystems)進行qPCR。將GAPDH和U6分別作為miR-200c-3p和Zeb1的內參基因。采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達水平。

1.5.2 CCK-8 將細胞株懸液(1×105/孔)置于96孔板中，每孔加入10 μL的CCK-8溶劑。將培養板在培養箱中孵育3 h，采用分光光度計計算450 nm處的吸光度以檢測細胞增殖能力。

1.5.3 流式細胞術分析 轉染后的細胞經收集用于流式細胞術。根據制造商說明書，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒雙染色后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。所有實驗均為3個重復。

1.5.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 培養上清液和滑膜液中的蛋白質水平通過ELISA試劑盒按照制造商的協議進行測定。

1.5.5 RNA pull down實驗 用生物素標記miR-200c-3p野生型和突變型探針，并與C-1磁珠在25℃孵育2 h形成探針吸附的磁珠。將細胞裂解液與探針4℃下孵育過夜。洗脫后，將磁珠吸附的RNA混合物洗脫，采用RNeasy Mini試劑盒提取RNA后進行RT-qPCR分析，計算RNA豐度。

1.5.6 雙熒光素酶報告基因實驗 擴增Zeb1的3′UTR片段，該片段包含預測的miR-200c-3p結合位點，并克隆到雙熒光素酶報告載體pmirGLO中。同時構建了Zeb1 3′UTR突變體熒光素酶報告基因。使用LipofectamineTM3000試劑將這三個載體與miR-200c-3p模擬物或陰性對照模擬物共轉染到細胞中。轉染48 h后收集細胞。使用雙熒光素酶報告系統檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-200c-3p在OA小鼠模型中低表達 RT-qPCR結果表明，與對照組和Sham組小鼠相比，OA小鼠關節軟骨中miR-200c-3p的表達明顯下調(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-200c-3p在OA小鼠模型中低表達Figure 1 miR-200c-3p in the low expression of OA in mice model 注：與對照組、Sham組比較，①P<0.05

2.2 過表達miR-200c-3p保護小鼠軟骨細胞免受脂多糖誘導的損傷 我們在體外構建骨關節炎細胞模型。RT-qPCR檢測發現LPS處理后的軟骨細胞中miR-200c-3p的表達顯著下調(圖2A)。為了進一步驗證miR-200c-3p對骨關節炎細胞生物學行為的影響，我們在LPS誘導的細胞中轉染miR-200c-3p mimics增加miR-200c-3p在LPS處理后的軟骨細胞中的表達(圖2B)。CCK-8實驗結果表明，LPS誘導軟骨細胞活性降低，而miR-200c-3p mimics逆轉了LPS處理導致的軟骨細胞活力的下降(圖2C)。此外，LPS處理后，軟骨細胞的凋亡顯著增多，而過表達miR-200c-3p顯著抑制脂多糖誘導的細胞凋亡(圖2D)。隨后，我們采用ELISA試劑盒檢測發現LPS誘導軟骨細胞中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量增加，而過表達miR-200c-3p顯著降低了LPS處理所導致的促炎細胞因子的產生(圖2E)。

圖2 過表達miR-200c-3p保護小鼠軟骨細胞免受脂多糖誘導的損傷Figure 2 Overexpression of miR-200c-3p to protect cartilage cells from damage induced by lipopolysaccharide in mice注：A.RT-qPCR檢測LPS處理和Control組軟骨細胞中miR-200c-3p的水平；B.RT-qPCR檢測Control、LPS、LPS+NC mimics和LPS+miR-200c-3p mimics組小鼠關節軟骨細胞中miR-200c-3p的水平；C.CCK-8法檢測LPS處理后，miR-200c-3p過表達導致的軟骨細胞增殖能力的變化；D.流式細胞術檢測LPS處理后，miR-200c-3p過表達導致的軟骨細胞凋亡的變化；E.ELISA檢測小鼠原代軟骨細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α在Control、LPS、LPS+NC mimics和LPS+miR-200c-3p mimics組水平。①P<0.05

2.3 Zeb1是miR-200c-3p的靶基因 為了進一步研究miR-200c-3p下游潛在的分子機制，我們使用包括microT和RNA22在內的在線生物信息學分析工具確定了6個miR-200c-3p的潛在的靶mRNA(圖3A)。RT-qPCR分析結果顯示，miR-200c-3p過表達后，只有Zeb1的表達水平顯著降低(圖3B)。此外，我們發現OA小鼠關節軟骨中以及LPS處理后的軟骨細胞中Zeb1的表達明顯上升 (圖3C)。為了進一步探究miR-200c-3p和Zeb1之間的關系，我們進行了RNA pull down實驗。結果顯示，Zeb1在野生型的miR-200c-3p探針下拉的RNA復合物中顯著富集，而在突變型的miR-200c-3p探針下拉的復合物中無顯著富集(圖3D)。另外，我們在Zeb1的3′UTR區域預測了miR-200c-3p的結合位點(圖3E)。為了驗證這一作用位點，我們將野生型或突變型的Zeb1 3′UTR片段克隆到熒光素酶報告基因載體中，然后將載體與miR-200c-3p mimics或NC mimics共轉染到細胞中。過表達miR-200c-3p顯著降低了野生型的熒光素酶活性，但對突變型的活性無顯著影響，表明miR-200c-3p靶向Zeb1 3′UTR(圖3F)。

圖3 Zeb1是miR-200c-3p的靶基因Figure 3 Zeb1 is miR-200c-3p target genes注：A.microT和RNA22在內的在線工具進行生物信息學預測6個miR-200c-3p的潛在的mRNAs；B.RT-qPCR檢測miR-200c-3p過表達對6個mRNAs表達的影響；C.RT-qPCR檢測OA小鼠、假手術小鼠和對照小鼠關節軟骨組織中Zeb1的水平以及LPS處理和Control組軟骨細胞Zeb1的水平；D.RNA pull down實驗驗證Zeb1和miR-200c-3p結合；E.Zeb13′UTR和miR-200c-3p的結合位點；F.熒光素酶報告基因實驗驗證Zeb13′UTR和miR-200c-3p的結合。①P<0.05

2.4 miR-200c-3p通過調控Zeb1保護小鼠軟骨細胞免受脂多糖誘導的損傷 我們在LPS處理的軟骨細胞中過表達Zeb1，RT-qPCR結果表明轉染了pcDNA3.1/Zeb1的細胞中Zeb1表達顯著高于轉染pcDNA3.1空載的細胞(圖4A)。隨后進行拯救實驗驗證miR-200c-3p/Zeb1軸對骨關節炎軟骨細胞功能的影響。CCK-8實驗結果表明，在LPS處理的軟骨細胞中，miR-200c-3p過表達導致的細胞活力的減少以及細胞凋亡的增加在共轉染pcDNA3.1/Zeb1后回升至初始水平(圖4B～D)。此外，Zeb1上調可以逆轉miR-200c-3p過表達抑制的IL-1β、IL-6和TNF-α的產生(圖4E)。

圖4 miR-200c-3p通過調控Zeb1保護小鼠軟骨細胞免受脂多糖誘導的損傷Figure 4 miR-200c-3p through regulating Zeb1 protect cartilage cells from damage induced by lipopolysaccharide in mice注：A.RT-qPCR檢測Control組、LPS、LPS+pcDNA3.1和LPS+pcDNA3.1/Zeb1組小鼠關節軟骨組織中Zeb1的水平；B.CCK-8法檢測LPS處理后，不同分組的軟骨細胞增殖；C.LPS處理后，不同分組的軟骨細胞活性；D.流式細胞分析檢測LPS處理后，不同分組的軟骨細胞凋亡；E.ELISA檢測不同分組小鼠原代軟骨細胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。①P<0.05

3 討論

越來越多的證據表明，miRNAs是人類疾病進展過程的重要參與者[10-15]。在骨關節炎中，miRNA-335-5p被報道能夠通過激活骨關節炎中的自噬來緩解軟骨細胞炎癥[16]。miR-29b-3p通過靶向PGRN促進軟骨細胞凋亡，促進骨關節炎的發生發展[17]。microRNA-455-3p通過直接靶向PAK2促進TGF-β信號轉導并抑制骨關節炎的發展[18]。據報道，miR-200c-3p的異常表達存在于不同類型的疾病中，并調控炎癥、血管生成和腫瘤發生等許多重要的生物學過程[19-23]。有研究報道miR-200c-3p在骨關節炎患者樣本中低表達[7]。然而，miR-200c-3p在骨關節炎細胞模型中的作用和潛在機制仍然有待研究。本研究證實了miR-200c-3p在骨關節炎小鼠軟骨中表達下調，并且發現其在LPS誘導的骨關節炎細胞模型中也呈現顯著下調。我們將miR-200c-3p模擬物轉染進骨關節炎細胞模型中，發現過表達miR-200c-3p可以保護軟骨細胞免受LPS誘導的細胞凋亡和炎癥損傷。

Zeb1是已知的誘導上皮間質轉化的轉錄調控因子，在正常的生理和病理過程中都起著重要的作用[24]。已有報道顯示內皮細胞Zeb1促進血管生成依賴的骨形成并逆轉骨質疏松癥[25]。Zeb1可作為microRNA-708靶基因共同參與調控乙醇誘導的肝脂質積累和炎癥反應[26]。然而，Zeb1與miR-200c-3p之間的關系仍有待進一步研究。本研究首先通過生物信息學分析工具篩選發現Zeb1是miR-200c-3p潛在的靶基因。此外，我們確認Zeb1在骨關節炎軟骨和LPS誘導的軟骨細胞中顯著上調。通過RNA pull down實驗和熒光素酶報告實驗，我們驗證了miR-200c-3p能夠靶向Zeb1的3′UTR。最后通過功能拯救實驗，我們發現Zeb1能夠參與miR-200c-3p調控的骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡和炎癥反應。這揭示了miR-200c-3p能夠靶向Zeb1調節炎癥信號來保護軟骨細胞。

4 結論

本研究表明miR-200c-3p直接靶向Zeb1的3′UTR結合，保護軟骨細胞免受脂多糖誘導的炎癥損傷，為發掘骨關節炎新的治療靶點提供了有價值的見解。