對奶牛布魯菌病的監(jiān)測方法探討

胡濤

（阿拉善右旗動物疫病預防控制中心，內蒙古 阿拉善 750300）

1 牛布魯菌病概述

1.1 臨床癥狀

該病常發(fā)地區(qū)的牛感染后一般多為慢性經過，臨床上幾乎看不到癥狀。潛伏期2周～6個月，奶牛最明顯的癥狀是流產，可發(fā)生于妊娠母牛的任何時期，但多發(fā)于妊娠后6～8個月，多見胎衣停滯。患牛多為帶菌者，奶牛產奶量下降。大多數(shù)感染母牛只流產1次，如果改善飼養(yǎng)管理條件，可達到自然痊愈的效果。公牛常見睪丸炎和附睪炎，急性期病牛睪丸腫痛，并可能伴有中度發(fā)熱，食欲減退，精液中含有大量布魯菌。慢性期病牛精液排菌量少，但是常呈間歇性排菌，有的牛排菌可持續(xù)數(shù)年。這類病牛還常見關節(jié)炎和滑液囊炎。

1.2 病理變化

1.2.1 剖檢變化。妊娠母牛子宮與胎膜的病理變化比較突出。流產前數(shù)天陰唇及陰道黏膜充血、水腫，流出惡臭的淡紅色黏液。子宮絨毛膜間隙中有污灰色或黃色惡臭膠樣滲出物。絨毛膜因充血而呈紫紅色，表面覆蓋有黃色壞死物和污灰色膿汁，常見深淺不一的糜爛面。胎膜因水腫而肥厚，呈膠樣浸潤外觀。由于母體胎盤與胎兒胎盤的炎癥及壞死等因素，影響胎兒對營養(yǎng)的吸收，導致死亡，出現(xiàn)流產，但是胎兒胎盤與母體胎盤粘連，引起胎衣滯留。如果繼發(fā)化膿菌感染，可發(fā)生化膿性子宮炎。病原菌長期潛伏，可發(fā)展為慢性子宮炎。外觀子宮體積增大，黏膜肥厚，并形成波紋狀皺褶，有時還可見局灶性壞死和潰瘍，或有息肉狀增生物形成。輸卵管腫大、變粗，黏膜增厚而有彈性。卵巢初期表現(xiàn)為漿液-纖維性炎，其后卵巢組織硬化，有時形成卵巢囊腫。乳腺常表現(xiàn)為間質性乳腺炎或繼發(fā)性萎縮及硬化。乳腺切面多見黃色小結節(jié)。公牛患布魯菌病時，可發(fā)生化膿-壞死性睪丸炎、附睪炎和精囊炎。睪丸顯著腫大、變硬，由于被膜粘連而不能滑動，切面下可見灰色干涸壞死和灰黃色膿性軟化灶。慢性病例還可見關節(jié)炎和腱鞘炎。

1.2.2 組織學變化。顯微鏡下觀察，可見母牛子宮絨毛膜充血、出血、水腫及炎性細胞浸潤，上皮細胞變性、壞死或發(fā)生膿性崩解。滲出物中含有脫落的上皮細胞、嗜中性粒細胞、組織壞死崩解產物及大量病原菌等。子宮固有層中有彌漫性或局灶性淋巴細胞浸潤，乳腺間質中有淋巴細胞和漿細胞浸潤及結締組織增生。鏡檢公牛可見大部分精小管發(fā)生萎縮，失去其多層結構，精原與精母細胞壞死、崩解，一些精小管內充滿崩解脫落的各類精細胞，嚴重時失去管狀結構。有的散有大量嗜中性粒細胞滲出、崩解，形成大小不等的囊腫。在囊腫周圍的間質中，除有浸潤的嗜中性粒細胞外，可見淋巴細胞和網狀細胞增殖，有上皮樣細胞結節(jié)和增生性結節(jié)。

1.3 病原學

牛種布魯菌是奶牛布病的主要病原，在羊布病流行區(qū)偶爾也感染羊種布魯菌，牛感染豬種布魯菌的病例則少見。各種生物型的牛種布魯菌對奶牛都有致病性，動物品種和性別對該病的感染沒有明顯區(qū)別，但是年齡和懷孕與否區(qū)別明顯。一般來說，犢牛和老齡牛對該病的感受性較低，而處在青春期的牛則較易感，懷孕奶牛的感染性最高。流產是該病的主要癥狀，產出死胎或軟弱犢牛，而且在產后排出大量病原菌，是引起畜間暴發(fā)和流行的主要根源。

成年健康牛對布魯菌具有相對高的易感性，高于幼畜但低于孕畜。幼畜由于生殖系統(tǒng)還未成熟和可以通過哺乳從母畜獲得抗體，所以對布魯菌的易感性低。老齡動物一方面由于它們的生殖功能已經衰退，對布魯菌不敏感；另一方面這些動物在其生命活動中或多或少地獲得了傳染后的免疫作用，所以對布魯菌的易感性也很低。

1.4 發(fā)病機制

流產材料如胎衣、胎兒和陰道排出物等含有大量病原菌，母牛乳汁和公牛精液中也有布魯菌存在。在自然感染情況下，布魯菌通過消化道、呼吸道、皮膚、黏膜和生殖道進入動物體內。病菌進入牛體后先在入侵部位短時間存活，然后經淋巴管進入淋巴結。如果病菌不被機體消滅，則在淋巴中生長繁殖，然后進入血流，引起菌血癥，導致體溫升高。進入血流中的布魯菌擴散到各個器官中，在停留的器官中引起病理變化。隨著病理過程向慢性化發(fā)展，菌血癥出現(xiàn)的機會減少。

2 血清布病抗體檢測方法

2.1 虎紅平板凝集試驗（RBT）

該試驗又稱班氏孟加拉紅平板凝集試驗。由于所用的抗原是酸性（pH 3.6～3.9）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中IgM類抗體的凝集活性，檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該反應的特異性。該方法簡便、快捷且容易操作，適用于基層大面積檢疫[1]。

2.2 試管凝集試驗（SAT）

該試驗又稱萊特凝集試驗。將奶牛血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 4 個稀釋度。 被檢奶牛血清凝集價為1∶100及以上時判定為陽性；血清凝集價為1∶50時判定為可疑[2]。該方法特異性較好，敏感性也高，但試驗步驟繁雜，耗時較長，不適用于基層大面積檢疫，僅適用于實驗室血清學確診。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

該試驗分為間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 （iELISA）和競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）2種方法。該方法具有敏感、特異和快速等特點。試驗用ELISA檢測儀讀取數(shù)值，相比試管凝集和虎紅平板凝集降低了主觀判斷的隨機性和不確定性。

3 奶樣布病抗體檢測方法

3.1 全乳環(huán)狀試驗（MRT）

3.1.1 原理。當乳汁中存在特異性布魯菌凝集抗體時，部分抗體被乳汁中的脂肪球吸附，與加入的帶色布魯菌抗原結合出現(xiàn)凝集反應，由于乳脂比重小而浮在乳汁表層，因此在乳脂層中形成帶色環(huán)狀帶，而其他部分無色。

3.1.2 試驗程序。取新鮮牛乳或混合奶1 mL置于小試管內，加入1滴乳環(huán)抗原（30～50 μL）充分混勻，置于37℃溫箱1 h后判定結果。

3.1.3 判定標準。①強陽性反應（＋＋＋）。乳柱上層乳脂形成明顯紅色環(huán)帶，乳柱白色，臨界分明。②陽性反應（＋＋）。乳脂層的環(huán)帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色。③弱陽性反應（＋）。乳脂層的環(huán)帶顏色較淺，但比乳柱顏色略深。④疑似反應（±）。乳脂層的環(huán)帶顏色不明顯，與乳柱分界不清，乳柱不褪色。⑤陰性反應（-），乳柱上層沒有任何變化，乳柱顏色均勻。

3.1.4 注意事項。奶牛奶樣必須是新鮮全脂乳，凡腐敗、變酸和凍結乳不宜作試驗用。夏季的乳應于當天檢測，保存于2～4℃冰箱內的乳7 d內可用；患乳腺炎及其他乳房疾患牛所產的乳以及初乳不宜作MRT，脫脂乳及煮沸過的乳也不能用[3]。

3.2 膠體金免疫層析試驗（GICA）

該方法屬于新型快速診斷法，也稱為布魯菌抗體快速檢測卡。方法是向裝有1 mL新鮮奶樣的1.5 mL EP管中滴加 2滴奶樣緩沖液，顛倒混勻后靜置5～10 min，待析出上清，將處理后的奶樣上清加入到檢測孔中反應20 min，與膠體金標記的抗原一起沿層析膜移動。如果樣品中存在布病抗體，則與檢測線上的布病抗原結合而顯色。

4 討論

目前對奶牛布病監(jiān)測主要采用血清抗體檢測，用虎紅平板凝集試驗作為初篩試驗，用試管凝集試驗或競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗作為血清學確診試驗。3種布病血清抗體檢測方法各有優(yōu)缺點：虎紅平板凝集試驗簡單快捷成本低，但不能確診，容易出現(xiàn)假陽性，而且容易因反應時間偏長造成誤差；試管凝集試驗步驟繁瑣，溶液需要在恒溫箱孵育18～24 h，結果需試驗人員肉眼辨別，存在主觀因素；競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗方法簡單，但是成本較高，對人員的專業(yè)性要求較高。最重要的是對于基層防疫員來講，開展采集奶牛血樣工作存在以下問題：一是奶牛保定較難；二是基層防疫員專業(yè)水平不高；三是頻繁采血監(jiān)測對奶牛產奶會造成一定影響。全乳環(huán)狀試驗和膠體金免疫層析試驗方法簡便、快捷，特異性和敏感性都較高。全乳環(huán)狀試驗1 h判定結果,布魯菌抗體快速檢測卡25 min左右即可判定結果。最關鍵的是奶樣相比較血樣更容易采集，這2種試驗在基層大面積檢疫和防疫工作中發(fā)揮了重要作用。

5 結論

要查明一個地區(qū)的牛群，特別是要確定哪一個牛群有布病存在，最有效和最準確的方法是取牛群的混合乳做全乳環(huán)狀試驗或膠體金免疫層析試驗。每個牛群的混合乳可以在收奶站或牛奶加工廠收集，也可以在混合乳漿罐運走之前收集。通過檢測混合乳，確定哪一個牛群有布病后，再用血清凝集試驗法逐頭檢查全場牛，了解布病在該場的流行情況。用這兩種方法檢查一個地區(qū)的牛群布病，比單獨采用血檢方法逐頭檢查該地區(qū)的全部牛群更高效便捷。