慢性哮喘小鼠氣道重塑情況觀察及發生機制探討

盧衛紅，吳湘濤，李多多，鄧翔，張星亮，徐亞利，李樹軍，馮沖

1 新鄉醫學院第一附屬醫院兒科，河南新鄉 453100；2 廣東醫科大學附屬醫院兒科；3 深圳市兒童醫院兒研所；4 合肥學院生物食品與環境學院

哮喘是兒童常見的慢性呼吸道疾患，患病率約3%，近年發病率呈持續上升趨勢［1］。哮喘的長期反復發作容易導致氣道特異性高反應性、氣道壁炎癥、氣道平滑肌增生和肥大等［2-5］。微小RNA（miRNA）是一類內源性的非編碼RNA，在調節過敏性疾病（比如哮喘）的發生發展過程中對氣道平滑肌的病理改變有重要作用［6］，但是其發揮作用的具體分子機制有待深入研究［7-10］。研究［11］顯示，自噬相關基因Atg5某些SNP位點與兒童哮喘相關。從自噬尋找哮喘治療靶點是一個新的研究領域，但自噬與氣道平滑肌和成纖維細胞的生理學等問題還需要進一步研究［11-13］。我們前期報道了 miR-3162-3p 首個靶蛋白為β-catenin 蛋白，并在急性哮喘小鼠模型上證明內源性 miR-3162-3p 降低肺組織 β-catenin 蛋白［14］。有文獻［11］報道，Wnt/β-catenin 通路和自噬信號存在相關性。因此，我們猜測miR-3162-3p/β-catenin 有可能通過調控自噬信號影響哮喘氣道平滑肌肥大增厚。2020 年3—12 月，我們觀察了慢性哮喘小鼠氣道重塑情況，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠25只，體質量（20± 2）g，購買于廣東省醫學實驗動物中心，在通風良好清潔的動物房中適應飼養3 d，溫度23～26 ℃，相對濕度52%～57%，明暗各半交替循環，自由飲水進食。鼠源βcatenin 單克隆抗體（ab32572，Abcam），鼠源β-actin多克隆抗體（4967S，CST），兔源LC3B-Ⅰ/Ⅱ單克隆抗體（12741，CST），HRP 標記山羊抗鼠 IgG（H+L）（E03012002，Earthox），HRP 標 記 山 羊 抗 兔 IgG（H+L）（A0208，碧云天），Goat Anti-rabbit IgG/ Alexa 488（4412S，CST），TGF-β1（240-B，CST），Tween 20（Amresco），雞卵清蛋白OVA（Grade V，Sigma），乙酰甲膽堿（Grade V，Sigma），DMEM 高糖培養基（Thermo Fisher Scientific），胎牛血清（16000-044）購于美國Gibco 公司。PageRuler Prest Protein Ladder（26616，Fermentas），miRNA mimics［百奧生物技術（南通）有限公司］，BeyoECL Plus（P0018M，碧云天），Lipo 3000（L3000075，Life Technologies），miRNA RT-PCR Kit（RR716）和 Mir-X ? miRNA First Strand Synthesis Ki（t638313）購于TAKARA，馬松三色染色試劑盒（G1340）購于北京索萊寶科技有限公司。引物合成及測序服務均有華大基因公司提供。BUXCO 無創動物肺功能儀購于美國Buxco 公司，KYWH1004 型霧化器購于佛山凱亞醫療科技有限公司，LightCycler? 480Ⅱ熒光定量PCR 系統購于美國羅氏公司，BioPhotometer 分光光度計儀購于德國 Eppendorf 公司，Biolmaging system 凝膠成像系統購于美國UVP 公司，TCS SPF5 Ⅱ徠卡激光共聚焦顯微鏡購于徠卡公司，蛋白垂直電泳儀購于Bio-Rad 儀器廠。

1.2 小鼠分組、哮喘模型制備及模型制備成功判定 取小鼠16 只，并隨機分為哮喘組和對照組（各8 只）。哮喘組于第0 和7 天腹腔注射致敏液（含25 μg 的 OVA，1 mg 佐劑明礬，溶于 0.2 mL 的 PBS，現配現用），第2 至12 周用激發液（125 mg 的 OVA溶于5 mL 的PBS，現配現用）霧化激發，每2 周2次，連續2 d，每次30 min。對照組采用PBS 替代致敏液和激化液。模型制備成功判定：①小鼠肺功能檢測：兩組小鼠均在末次激發后24 h 進行肺功能檢測。將4 只清醒狀態小鼠分別放進Buxco 無創肺功能儀中，測定基礎值，包括呼吸頻率（F）、潮氣量（TV）、每分鐘通氣量（MV）、吸氣時間（Ti）、呼氣時間（TE）、吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流速（PEF）、呼吸 間 歇（Pause）和 PenH 值（PenH=Pause×PEF／PIF）。PenH 主要反映了氣道阻力。小鼠霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿溶液（0、3.12、6.25、12.50、25.00 mg/mL），每次霧化2 min，反應、記錄時間為3 min，恢復時間為1 min。計算小鼠的PenH，方法參照文獻［14-15］。與對照組相比，哮喘組 PenH 顯著升高，提示氣道呈高反應狀態。②小鼠肺泡灌洗液（BALF）中細胞總數及細胞分類計數：將哮喘組和對照組小鼠仰臥位固定在小動物手術臺上，剪開頸部和胸部中間皮膚和肌肉暴露氣管和胸廓。采用眼科手術剪將肺與膈肌及相關黏連完全剝離，結扎左肺支氣管根部（支氣管分叉處附近）和氣管遠心端，剪取左肺用于小鼠肺支氣管厚度和膠原沉積檢測。用靜脈留置針插入右肺相通的氣管內約0.2 cm 后拔針芯，同時向前推進留置針軟管約0.3～0.4 cm 處固定。注射器抽取0.5 mL 生理鹽水緩慢注入右肺，待肺組織膨脹后數秒后回抽，灌洗3 次，每次回收率不低于80%。將收集好的BALF 在 4 ℃和800 g的條件下離心5 min 棄上清，用100 μL 生理鹽水充分重懸混勻細胞團，取混勻的重懸液10 μL 滴入血球計數板，于低倍鏡下計數（四角大方格，每大方格又分16個小方格），細胞懸液細胞數/mL=（4 個大格細胞總數/4）×104。將 50 μL 的BALF 細胞重懸液在玻片上涂片，立即熱風干，約30 min 后進行瑞氏—吉薩姆染色，計算細胞分類。方法參照文獻［14-15］。收集BALF 進行白細胞總數和分類計數，與正常組相比，哮喘組總細胞數量增加了近6倍，嗜酸性粒細胞的百分含量顯著升高，但是淋巴細胞的百分含量明顯下降。氣道反應性和BALF細胞計數的結果提示，OVA-慢性哮喘小鼠模型構建成功。

1.3 小鼠肺支氣管厚度和膠原沉積的檢測 取“1.2”實驗剪取好的兩組（各6 只）小鼠左側肺葉中部，置于4%多聚甲醛溶液中固定。脫水透明和浸蠟包埋后進行連續切片（厚度約3 μm）、烤片、染色、洗片、封片等操作，采用馬松三色染色試劑盒。在倒置光鏡下觀察肺組織病理學形態，隨機選擇5 個直徑100～200 μm 的支氣管橫截面，并通過圖像采集系統獲取圖像。使用圖像分析軟件Image-pro Plus 6.0測量基底膜周長（Pbm）、平滑肌面積（Wam）和基底膜下膠原面積（Wcol）。計算平滑肌層厚度（Wam/Pbm，μm2/μm）和基底膜下膠原沉積厚度（Wcol/Pbm，μm2/μm）。

1.4 小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白檢測 ①miR-3162-3p：采用qRT-PCR法。取每組小鼠（各3只）右肺組織20～30 mg，液氮研磨，然后采用天根公司 miRcute miRNA Isolation kit（DP501）試劑盒提取小鼠肺組織的microRNA。采用TaKaRa公司的 SYBR? PrimeScript ? miRNA RT-PCR Kit（RR716）試劑盒進行miR-3162-3p 的逆轉錄和實時熒光定量PCR。miR-3162-3p：5’-UCCCUACCCCUCCACUCCCCA-3’，5’-CTACCCCTCCACTCCCCAAAA-3’，RNU6B：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’，5’-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’。Light-Cycler 480Ⅱ擴增儀進行實時熒光定量PCR 和數據分析。采用2-ΔΔCt值相對定量法計算目標基因的轉錄水平。方法參照文獻［14］。②β-catenin、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白：采用Western blot 法。取每組小鼠（各3 只）左肺中下葉組織100 mg，用預冷的PBS 洗滌肺組織后置于預冷的研缽內（后續步驟均在冰上完成），加適量液氮，充分研磨后采用移液槍吸取肺組織勻漿至1 mL 的EP 管內。對于小鼠氣道平滑肌細胞，各組收集一個6 孔板細胞，棄培養基后加入PBS 沖洗3次。加適量RIPA 蛋白裂解液及蛋白抑制劑，靜置20 min 充分裂解組織和細胞后于4 ℃環境下以13 000 g 條件離心10 min，保留上清液，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測量上清液中總蛋白濃度。取30 μg總蛋白的上清液加入適量緩沖液煮沸5 min后上樣，采用10%SDS-PAGE 進行分離，然后采用PVDF 膜濕 轉 ，5% 脫 脂奶 粉室 溫封 閉 1 h，加入LC3B-Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000）或者 β-catenin 一抗（1∶3 000）于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后采用相應種屬HRP 標記的二抗（1∶2 000）在室溫下反應 2 h，ECL 化學發光法在暗室曝光。以β-actin（1∶3 000）作為內參。實驗重復3 次。采用Image J 圖像分析軟件采集信號和灰度掃描。

1.5 小鼠氣道平滑肌細胞分組、miR-3162-3p mimic轉染及LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白檢測 斷頸法處死小鼠（每組5 只），在75%酒精中浸泡2 min，快速分離氣管，放入D-Hanks 液（含100 U/mL 青鏈霉素）中，在超凈臺內去凈氣管外周組織后縱切氣管，小心去除內外膜，使用眼科剪將氣管剪成約1 mm3小組織塊，貼在25 mL 培養瓶底，加入 2 mL 高糖 DMEM 培養基（含20%胎牛血清），不使培養液接觸組織塊。倒置培養瓶，37 ℃和5%CO2培養箱中靜置約3 h。組織塊將近干涸時緩慢再次倒置培養瓶，使得培養液剛好覆蓋組織塊表面，靜置培養3 d 后添加培養液至5 mL，在第6天換液，此后每3天換1次液。在光學顯微鏡下觀察組織塊邊緣細胞逐漸匯合達80%即可進行首次傳代。棄培養基后2 mL 的D-Hanks 液清洗3次，加入0.25%胰酶消化，顯微鏡下細胞邊緣透亮且胞質回縮后加入15%胎牛血清的培養基終止消化，吹打成單細胞懸液鋪板接種。采用差速貼壁法去除成纖維細胞。含有10%胎牛血清、終濃度100 U/mL 的青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2，飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每隔2 d 換液，細胞長勢良好時每3 d 傳代1次，以上細胞原代培養參照文獻［16］。當細胞處于對數生長期，分成兩組，對照組加入PBS，Mimic 組轉染 miR-3162-3p mimic（5'-UCCCUACCCCUCCACUC CCCA-3'，5'-UGGGGAGUGGAGGGGUAGGGA-3'），各組在6 孔板中鋪入細胞。24 h 后，再添加TGF-β1（2 ng/mL）孵育24 h。小鼠氣道平滑肌細胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達和分布檢測：采用免疫熒光實驗檢測。將小鼠氣道平滑肌細胞以5×104的密度鋪于底部有玻片的6 孔細胞板，干擾處理24 h 后，采用PBS沖洗細胞，4%多聚甲醛固定，1%Triton 通透細胞膜，LC3B-Ⅱ/Ⅰ一抗孵育12 h，孵育Alexa 488 標記的兔IgG 抗體。采用DAPI 重新固定細胞核，并通過共聚焦成像。參照文獻［17］方法。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用雙樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠肺支氣管厚度變化及支氣管平滑肌厚度、基底膜下膠原沉積厚度比較 兩組小鼠支氣管厚度變化見圖1，由圖1可知，對照組馬松三色染色結果顯示肺泡間隔勻稱、支氣管結構清晰正常；哮喘組肺組織結構不均勻，偶見支氣管上皮細胞疏散，哮喘組的支氣管平滑肌肌層肥厚，上皮下纖維化明顯增多，基底膜增厚，支氣管周圍藍色膠原沉積加重。哮喘組、對照組支氣管平滑肌厚度分別為（11.120 0±0.342 7）、（4.110 0 ± 0.202 9）μm2/μm，基底膜下膠原沉積厚度分別為（39.130 0 ± 1.072 0）、（14.100 0 ±0.444 7）μm2/μm，兩組比較，P均＜0.05。

圖1 兩組小鼠支氣管厚度、基底膜下膠原沉積厚度變化（馬松三色染色，×200）

2.2 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin 蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較 小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin 蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較見表1。

表1 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較（）

表1 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別哮喘組對照組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白1.200 00±0.056 82*1±0 miR-3162-3p 2.362 0±0.116 2*1±0 β-catenin蛋白0.428 90±0.077 12*1±0

2.3 兩組小鼠氣道平滑肌細胞轉染miR-3162-3p mimic 后LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較 在TGF-β1誘導支氣管平滑肌肥大增厚模型上，轉染miR-3162-3p mimic后，免疫熒光技術檢測結果顯示LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白在細胞質中熒光強度較對照組明顯增強，提示自噬水平大幅上調（圖2A）。WB 檢測結果顯示，Mimic 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例明顯增多，灰度值分析顯示Mimic組和對照組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值分別為1.969 0 ± 0.174 1、1 ± 0，P＜0.05，進一步證實自噬水平上升（圖2B）。

圖2 兩組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達分布和水平

3 討論

慢性哮喘是呼吸科常見的一種氣管慢性炎癥反復發作的疾病，以氣道炎癥、咳嗽、喘息、呼吸急促、胸悶等典型特征和氣流受限作為診斷的主要依據［18］。目前認為，慢性哮喘可以引起氣道重構，是導致氣道不完全可逆狹窄的重要原因。氣道重構的主要表現包括氣道平滑肌細胞增生和肥大、氣道上皮基底膜增厚和基底膜下膠原沉積、氣道上皮細胞增殖以及杯狀細胞化生［19］。哮喘治療方案中重要的手段之一是吸入糖皮質激素，但糖皮質激素的使用會對兒童的發育和成長產生深遠的影響，如激素依賴和抵抗或是股骨頭壞死或生長抑制等不良反應［20］。布地奈德福莫特羅粉吸入劑為吸入性糖皮質激素/長效β2受體激動劑，作為中至重度持續發作哮喘患者的長期治療藥而被使用，可獲得優于加倍劑量糖皮質激素的功效，但仍存在不少不良反應。因此，探索哮喘新治療方案一直是呼吸系統疾病研究領域關注的重點［10］。miRNA 在特定的組織和發育階段、疾病發生的某個過程發揮調控功能。已有研究［21］證實，與疾病相關的多種miRNA 具有被開發成診斷試劑盒或治療性藥物的潛力。在急性哮喘小鼠模型上我們已經證實，miR-3162-3p可以靶向下調β-catenin蛋白，miR-3162-3p 抑制劑保護肺組織β-catenin 蛋白，降低肺組織的炎癥水平［14］。本研究旨在慢性哮喘小鼠模型上研究miR-3162-3p 及靶蛋白的變化以及初步探討其影響氣道重塑的分子機制。目前已有研究表明，miRNAs 參與哮喘的發生及發展。文獻［22］報道，miR-20b 誘導慢性哮喘小鼠肺髓源性抑制細胞增多。miRNA-142 通過抑制TGF-β 依賴性EGFR 信號通路，抑制哮喘大鼠氣道重塑過程中氣道平滑肌細胞增殖和凋亡［23］。研究［6］顯示，miR-485通過靶向Smurf2 調節慢性哮喘小鼠TGF-β/Smads信號通路，肺組織中3 種miRNA 增高或者降低。采用OVA 霧化激發6 周建立慢性哮喘小鼠，發現氣道壁miRNA 表達水平先上升后逐漸下降［4］。本文構建12 周的慢性哮喘小鼠模型，發現其氣道反應性明顯比對照組小鼠高，表明慢性哮喘小鼠的肺功能下降；BALF 細胞計數結果顯示慢性哮喘小鼠氣道炎癥浸潤明顯增多；馬松三色染色的結果顯示慢性哮喘小鼠氣道平滑肌增厚、膠原沉積顯著增多，證明氣道明顯變狹窄；與對照組比較，慢性哮喘小鼠肺組織中miR-3162-3p 表達水平上升，提示miR-3162-3p 在慢性哮喘小鼠氣道重塑中可能發揮重要作用。

有研究［24］顯示，β-catenin 蛋白在調節慢阻肺氣道重塑中有重要作用，比如miR-337。β-catenin 蛋白還可以影響人氣道成纖維細胞［25］、人氣道上皮細胞［26］或氣道平滑肌細胞［27］進而影響氣道重塑。本文觀察到慢性哮喘小鼠肺組織miR-3162-3p 的靶蛋白β-catenin 明顯下調。Wnt/β-catenin 通路和自噬相互關聯，自噬基因Atg5 表達減弱導致β-catenin 蛋白表達增加；β-catenin蛋白表達增加，自噬減弱［11］。自噬激活Src，促進Src 相關的β-catenin 蛋白在Y-654磷酸化，形成 pY654-β-catenin/p-Smad2 復合物，促進TGF-β1誘導小鼠腎小管上皮C1.1 細胞的上皮間質轉化［28］。在小鼠的 PanIN 細胞中，經典 Wnt3a 配體能誘導自噬標志物［29］。β-catenin 蛋白和自噬之間存在調控或者被調控的關系，但是沒有明確一致的關系，可能與細胞或者組織的特異性有關［30］。TGF-β1是哮喘患者氣道重塑的關鍵細胞因子，可以引起細胞外基質增加以及氣道平滑肌細胞的肥大［31］。本文采用TGF-β1誘導氣道平滑肌細胞肥大，證實miR-3162-3p mimic 能促使肥大型氣道平滑肌細胞自噬水平上升。因此可以推測，在氣道平滑肌細胞上，miR-3162-3p 靶向β-catenin 蛋白促進了細胞自噬水平上調，這可能影響慢性哮喘小鼠氣道重塑的發病機制。

總之，miR-3162-3p 可能是通過下調β-catenin蛋白的表達，促進氣道平滑肌細胞自噬水平上調，減輕OVA 誘導的慢性哮喘導致的氣道平滑肌增厚和基底膜下的膠原沉積，緩解了氣道狹窄。