不同病情及病程CAP新生兒外周血維生素D、淋巴細胞亞群、中性粒細胞吞噬功能比較及相關性分析

沈懷云，王磊，夏群，刁艷霞，周夢竹

蚌埠醫學院第一附屬醫院兒科，安徽蚌埠 233004

新生兒社區獲得性肺炎（CAP）是一種常見的新生兒出生后感染性肺炎，病原體主要包括細菌、病毒及其他病原體，如金黃色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒等，一些革蘭氏陰性桿菌或與病毒混合感染后所致足月新生兒CAP 病死率大大增加［1-3］。一些病原體如細菌在肺部的感染會激活患兒免疫系統，產生了一系列免疫應答，從而使宿主細胞表面抗原結構發生改變，最終導致患兒免疫系統功能紊亂，病情進展迅速者甚至死亡［4-6］。維生素D（VD）是一種脂溶性維生素，具有維持體內鈣穩定和調節機體免疫功能等作用，尤其與小兒呼吸道感染密切相關。CAP 目前已經成為了新生兒階段最為嚴重的感染性疾病之一，且其臨床癥狀和體征缺乏特異性，監測不同病情和病程CAP 新生兒免疫功能及其影響因素如VD 含量，是保護此類新生兒個體安全的關鍵點。2019 年11 月—2021 年11 月，我們比較了不同病情及病程CAP 新生兒外周血VD、淋巴細胞亞群、中性粒細胞（NE）吞噬功能，并分析VD 含量和免疫功能的相關性，旨在為新生兒CAP 病情輕重、病程進展及療效評估提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取蚌埠醫學院第一附屬醫院收治 的 CAP 新 生 兒 62 例 ，男 32 例 ，女 30 例 ；胎 齡（39.23 ± 1.02）周，日齡中位數17.5（14～25）d；體質量（3.58 ± 0.51）kg。新生兒CAP 包括院外感染院外發病和院外感染入院后在潛伏期內發病患兒。所有新生兒CAP 病例均符合《諸福棠實用兒科學》（第8 版）以及兒童CAP 管理指南診斷標準［7］：①咳嗽，氣促，痰鳴，伴或不伴發熱、黃疸等癥狀；②表現為紫紺、口吐泡沫或者伴有呻吟、呼吸困難或吸氣性三凹征；③雙肺聞及呼吸音粗或者干濕啰音；④X 線胸片顯示為斑點狀條絮影或斑片狀、片狀陰影，伴或不伴肺氣腫。根據病情分為輕癥者40例（輕癥組）、重癥者22例（重癥組）（新生兒重癥CAP符合上述兒童CAP 管理指南重癥肺炎診斷標準［7］：①在吸入氣中氧濃度分數≥60%的情況下，不能維持動脈血氧飽和度≥92%；②出現休克；③呼吸頻率增快，脈速伴嚴重呼吸窘迫和多器官功能衰竭，伴或者不伴動脈血氧分壓升高；④反復出現呼吸暫停或慢而不規則的呼吸）。根據病程分為急性期（入院后24 h 內，急性組）、恢復期（治療7 d病情好轉時，恢復組）。另選擇同期健康體檢新生兒30 例（對照組），男18 例，女12 例；胎齡（39.15 ± 1.38）周，日齡中位數 16（12.75～24.25）d；體質量（3.51± 0.54）kg。兩組一般資料比較無統計學差異，具有可比性。排除標準：①出生時有嚴重的先天性發育畸形和遺傳代謝性疾病；②吸入性肺炎等非感染性肺炎；③入組前使用過相關影響檢測指標的藥物。本研究已報醫院的倫理委員會審核，并獲得批準，所有新生兒家長都在告知書上簽名表示同意。

1.2 外周血VD、淋巴細胞亞群、NE 吞噬功能指標檢測 取空腹狀態下采集各組新生兒靜脈血各3 mL。①VD：采用WATERS 公司的高效液相色譜儀檢測25 羥維生素D［25（OH）D］含量。抽取靜脈血1 mL，離心取0.5 mL 血清以甲醇沉淀蛋白，以正己烷提取后，離心取上清液過膜。甲醇∶水（95∶5）為流動相，選用 Venusil MP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行色譜分離，流速為1 mL/min，紫外檢測波長265 nm，柱溫30 ℃。②淋巴細胞亞群：使用真空采血管（EDTA-K2 抗凝）抽取靜脈血1 mL，將標本管編號為A 與B，A 管內加入CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 試劑20 μL，B 管 內 加 入 CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC試劑20 μL，向A管與B管內各加入100 μL全血，輕輕搖勻，避光置室溫孵育共15 min，向兩管內各加入FACSLysing 溶血液2 mL，避光置室溫孵育共10 min，300 g離心5 min，棄去上清液，以PBS洗滌細胞 2 次，300 g 離心 5 min，同樣棄去上清液，再向A、B 管內各加入1%的聚甲醛0.5 mL，采用美國BD公司的FACSCalibur 流式細胞儀進行檢測，用Multi-SET 程序分析淋巴細胞各亞群的相對計數，最后讀取結果。③NE吞噬率及吞噬指數：將金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213置于水浴中加熱至100 ℃，總共10 min，以殺滅細菌，再以無菌生理鹽水稀釋成6×108/mL備用；吸取60 μL肝素鈉抗凝血液滴入凹玻片的凹孔內，加上述制備好的葡萄球菌菌液20 μL，進行充分混勻；并置入鋪有濕紗布的有蓋容器中，于37 ℃溫箱中作用30 min，期間每10 min搖勻一次；作用完畢后，吸取1小滴混合液置于潔凈的載玻片一端，推成薄片、晾干，采用快速瑞—姬氏染色劑染色10 min，清水沖洗和晾干后在油鏡下隨機尋找100個NE，計算 NE 吞噬率及噬指數（吞噬率=100 個NE 中吞噬細菌的細胞數/100×100%，吞噬指數=100個NE中吞噬細菌的總數/100）［8］。

1.3 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析，其中兩兩比較用獨立樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法；采用Spearman 秩相關作兩變量相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 輕癥組及重癥組和對照組外周血VD 含量、淋巴細胞亞群、NE 吞噬功能指標比較 結果見表1。

表1 輕癥組及重癥組和對照組外周血VD含量、淋巴細胞亞群、NE吞噬功能指標比較（）

表1 輕癥組及重癥組和對照組外周血VD含量、淋巴細胞亞群、NE吞噬功能指標比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與輕癥組比較，＃P＜0.05。

組別輕癥組重癥組對照組NE吞噬指數3.01±0.97*2.26±0.93*＃3.61±0.29 n 40 22 30 25（OH）D（ng/mL）15.98±2.91*13.96 ± 3.04*＃18.08±4.00 CD3+（%）80.54±7.42*73.70±6.76*＃84.47±5.09 CD4+（%）58.53±6.86*52.66 ± 5.64*＃63.17±4.03 CD8+（%）20.12±0.70 19.59±1.46 19.82±1.39 CD19+（%）12.21±3.69*15.86±4.86*＃9.51±3.42 CD56+（%）10.50±3.27*8.44 ± 2.90*＃12.84±2.32 NE吞噬率（%）55.41±14.27*43.10 ± 13.37*＃62.10± 7.04

2.2 急性組及恢復組和對照組外周血VD 含量、淋巴細胞亞群、NE吞噬功能指標比較 結果見表2。

表2 急性組及恢復組和對照組外周血VD含量、淋巴細胞亞群、NE吞噬功能指標比較（）

表2 急性組及恢復組和對照組外周血VD含量、淋巴細胞亞群、NE吞噬功能指標比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與恢復組比較，＃P＜0.05。

組別急性組恢復組對照組NE吞噬指數2.75±1.01*＃3.09±0.78*3.61±0.29 n 62 62 30 25（OH）D（ng/mL）15.26 ± 3.09*＃16.57±3.33*18.08±4.00 CD3+（%）78.15 ± 7.83*＃81.29±6.03*84.47±5.09 CD4+（%）56.45 ± 7.00*＃59.42±5.57*63.17±4.03 CD8+（%）19.93±1.06 19.99±0.95 19.82±1.39 CD19+（%）13.50±4.47*＃11.69±3.37*9.51±3.42 CD56+（%）9.77 ± 3.27*＃11.10±2.47*12.84±2.32 NE吞噬率（%）51.04 ± 15.06*＃55.76±11.50*62.10± 7.04

2.3 急性期組VD含量與淋巴細胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數相關性分析 急性組VD 含量與CD3+、CD4+、CD56+細胞及NE 吞噬率、吞噬指數呈正相關（r分別為 0.354、0.321、0.386、0.520、0.559，P均＜0.05），與 CD19+細胞呈負相關（r為-0.342，P＜0.05），與CD8+細胞無相關性（r為0.130，P＞0.05）。

3 討論

新生兒CAP 是由各種病原體感染引起的彌漫性肺部病變，如不及時治療常會造成患兒呼吸困難，甚至呼吸衰竭，嚴重者可導致患兒死亡或因缺氧留下神經系統后遺癥。由于CAP 的流行病學正在發生變化，且導致CAP 的病原體在不同的國家和地區之間存在差異，大多數細菌性新生兒CAP 是經驗性治療，選擇適當的抗生素治療越來越困難，同時新生兒免疫功能極不成熟，因此新生兒CAP 的治療對兒科醫師來說具有很大的挑戰性。

VD 是促進機體骨骼生長和調節其免疫功能的重要微量營養素。VD 信號轉導通過激素形式的1，25-二羥維生素D與核VD受體結合發揮對機體先天性免疫和適應性免疫的調控，還可通過調節T 細胞中的 mTOR 途徑實現免疫穩態［9］。因此，VD 信號轉導應該能提高機體對抗細菌或病毒等病原體感染的免疫力。VD 缺乏會明顯增加人體感染病原體的幾率，且感染后病情易進展和加重。臨床研究已證明，血清25（OH）D 缺乏的老年新冠肺炎患者肺受累更嚴重、病程更長和死亡風險更高，即使在并發癥較少的年輕新冠肺炎患者中，也檢測到VD 水平較低［10］。劉梁等［11］報道，感染性肺炎患兒的血清 25（OH）D 水平較低，且病情較重者的水平更低。近期還有研究認為，低濃度的血清VD 與新生兒肺炎有顯著的相關性，且VD 水平可以預測新生兒肺炎的機械通氣需求和住院時間［12］。25（OH）D 缺乏的新生兒患感染性肺炎的風險增加，且重癥肺炎新生兒外周血單個核細胞VD 受體表達下調［13］。本研究結果中輕癥組及重癥組VD 含量顯著低于對照組，重癥觀察組VD 含量低于輕癥者，說明血清VD 含量與新生兒CAP 病情輕重有關，VD 水平越低，患兒病情可能越重；急性組及恢復組VD 含量均低于對照組，提示低VD 含量與新生兒CAP 發生關系密切，且在急性期降低后短期內無法完全恢復正常。CAP新生兒血清VD 水平降低可能與肺部感染后患兒對VD的吸收減少、同時機體處于高代謝狀態，對VD 的需求和排出增加等一些因素有關。

機體的免疫細胞由固有免疫細胞與適應性免疫細胞組成。固有免疫細胞主要包括NK 細胞、NE、樹突狀細胞等等，固有免疫細胞參與天然免疫反應，發揮非特異性免疫功能，如NK細胞、NE不需要抗原的刺激，也能自發地殺傷靶細胞；適應性免疫細胞包括T 淋巴細胞和B 淋巴細胞，它們除具有天然免疫細胞的免疫功能外，還可對一些病原體感染作出針對性反應，從而產生后天獲得性免疫反應，發揮特異性免疫功能。各個淋巴細胞亞群應維持一定的數量和比例，并且相互作用才能維持機體正常的免疫功能。新生兒免疫系統功能薄弱，在罹患呼吸道感染性疾病后，免疫系統更易受到損害，淋巴細胞亞群往往會發生變化。MCGRATH-MORROW 等［14］將新生和幼年小鼠分別吸入大腸桿菌致下呼吸道感染后，發現新生小鼠肺部固有免疫細胞招募延遲，肺部細菌清除也明顯延遲，并且死亡率更高。另外文獻［15］報道，新生小鼠肺炎時對肺部CD4+T 細胞轉錄反應減弱。有研究［16-17］認為，細菌性肺炎的新生兒CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細胞均降低，而CD19+B 淋巴細胞升高，病情越重，住院時間越長，NK細胞及其亞群的比例越低。吳秀霞等［18］發現，感染性肺炎新生兒CD3+、CD4+T淋巴細胞和NK 細胞比例較對照組顯著降低，CD8+T 細胞、CD19+B 細胞比例較對照組顯著升高，但CD19+B細胞產生免疫球蛋白的功能是低于對照組的。目前，針對感染性肺炎患兒NE 功能變化的研究較少。袁浩等［8］發現，肺炎支原體肺炎患兒外周血NE 吞噬率及吞噬指數較健康對照組下降，表明患兒肺部感染后，機體非特異性免疫NE 吞噬功能下降。本研究顯示，輕癥組及重癥組CD3+、CD4+、CD56+細胞水平及NE 吞噬率、吞噬指數顯著低于對照組，CD19+細胞水平高于對照組；重癥組CD3+、CD4+、CD56+細胞水平及 NE 吞噬率、吞噬指數低于輕癥組，CD19+細胞水平高于輕癥組；提示淋巴細胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數與新生兒CAP的病情輕重有關，患兒病情越重，特異性和非特異性免疫功能紊亂越嚴重。本研究還顯示，急性組和恢復組CD3+、CD4+、CD56+細胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數均低于對照組，CD19+細胞水平高于對照組；急性組 CD3+、CD4+、CD56+細胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數低于恢復組，CD19+細胞水平高于恢復組；提示淋巴細胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數與新生兒CAP的病程進展有一定關聯。隨著CAP 患兒病情好轉，CD3+、CD4+、CD56+細胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數升高，CD19+細胞水平下降，但在恢復期這些特異性和非特異性免疫指標并不能達到正常新生兒水平。

VD 水平對呼吸道感染患兒特異性免疫功能如細胞免疫的影響已有不少報道。賀媛媛等［19］發現，反復呼吸道感染患兒血清VD 水平與全血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈正相關，而與全血 CD8+水平呈負相關。還有學者報道，CAP 新生兒25（OH）D 缺乏組CD3+、CD4+細胞陽性率及CD4+/CD8+均低于25（OH）D 正常組，細胞免疫與25（OH）D 水平相關，25（OH）D 缺乏患兒細胞免疫功能相對低下［20］。因此，VD 水平與呼吸道感染小兒的細胞免疫功能具有相關性。但VD 水平與呼吸道感染患兒非特異性免疫如NE吞噬功能的關系尚無相關報道。本文結果顯示，CAP 新生兒急性期 VD 含量與 CD3+、CD4+、CD56+細胞及NE 吞噬率和吞噬指數存在正相關，而與CD19+細胞存在負相關，提示CAP 新生兒急性期VD 含量與淋巴細胞亞群、NE 吞噬功能之間存在一定的關聯，VD含量減少會導致患兒特異性和非特異性免疫功能受損，它們共同參與和反映了新生兒CAP 的病情進展。

總之，CAP 新生兒外周血VD 含量減少，特異性和非特異性免疫功能紊亂，且與病情輕重和疾病進程密切關聯，新生兒CAP 急性期VD 含量與淋巴細胞亞群、NE 吞噬功能之間具有一定的相關性。因此，在新生兒CAP 的治療過程中，通過調節VD 水平，從而改善免疫功能，是否有助于患兒病情的恢復，值得我們進一步研究。