干擾FTO蛋白對人卵巢癌細胞系SKOV3增殖、遷移、侵襲的影響及其機制

黃錦源，楊靜，代蔭梅

首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院婦科，北京 100026

卵巢癌是婦科常見三大惡性腫瘤之一，在婦科惡性腫瘤中病死率最高，患者預后差［1］。卵巢癌患者早期臨床癥狀不明顯或無特異性，超過75%的病例在晚期才被確診［2］。盡管大多數患者受益于手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但卵巢癌的難以早期診斷、復發和耐藥等問題導致整體患者預后不佳。文獻［2］報道，卵巢癌的治療取決于癌細胞本身的內在特征。因此，迫切需要研究卵巢癌進展相關基因改變和潛在分子機制。脂肪量和肥胖相關蛋白（FTO）是N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，位于染色體 16q12.2 上［3］。FTO 在惡性腫瘤中具有差異性表達，影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、腫瘤干細胞特性和耐藥等惡性生物學行為［4］。FTO 在卵巢癌中表達水平及其發生發展過程中的作用相關研究較少，且不同研究間存在較大差異，可能發揮促癌或抑癌作用。本實驗選取對數生長期人卵巢癌腺癌細胞系SKOV3，并分別轉染第一條靶向FTO 的小干擾RNA（siFTO-1）、第二條靶向FTO的小干擾RNA（siFTO-2），并以無靶向作用的小干擾RNA（si-NC）作對照，觀察干擾FTO 對SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并探討其可能機制，以期驗證FTO 發揮促癌或抑癌作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 SKOV3 細胞購自美國ATCC細胞庫。高糖DMEM培養基、Opti-MEM Ⅰ減血清培養基和胎牛血清均購自美國Gbico 公司，TRIzol Reagent 購 自 美 國 Ambion 公 司 ，ColorMixed Protein Marker、逆轉錄試劑盒和 2×SYBR Green qPCR Mix 試劑盒均購自武漢 ABclonal 公司，FTO 引物和GAPDH 內參引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，Lipofectamine 2000 購自美國 invitrogen 公司，si-NC、siFTO-1、siFTO-2 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，AKT 抗體、p-AKT 抗體、PI3K 抗體、p-PI3K 抗體和GAPDH 內參抗體均購自美國CST公司，FTO 抗體購自英國 Abcam 公司，ECL 試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司，CCK-8 試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司。Nano-300微型分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司，熒光定量PCR 儀購自美國BIO-RAD 公司，CO2恒溫培養箱和多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific 公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus IX51，Tanon 5200 系列全自動化學發光/熒光圖像分析系統為上海天能科技有限公司。

1.2 SKOV3細胞培養及siFTO-1、siFTO-2轉染和分組 SKOV3細胞系培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養基，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養箱培養。根據細胞生長狀況和培養液顏色變化進行細胞換液或胰酶消化傳代培養。取對數生長期SKOV3 細胞，進行胰酶消化，后用培養基重懸，按2×105細胞/孔接種于六孔板培養，待細胞生長融合度達到70%時，分別取si-NC、siFTO-1、siFTO-2（各40 pmol）與Opti-MEM I 減血清培養基（125 μL）、Lipofectamine 2000（4 μL）充分混勻，37 ℃孵育20 min；分別將si-NC、siFTO-1、siFTO-2 轉染混勻液加入已接種 SKOV3 細胞的六孔板中，轉染4 h 后將培養液更換為高糖DMEM 新鮮培養基；轉染后細胞分別標記為si-NC組、siFTO-1 組、siFTO-2 組（其中 siFTO-1 組、siFTO-2組主要起到平行重復實驗和避免siRNA序列誤差的作用）。采用qRT-PCR 法和Western blotting 法分別檢測各組FTO mRNA、蛋白相對表達量以判定轉染效率。qRT-PCR 結果顯示，si-NC組、siFTO-1組、siFTO-2組FTO mRNA 相對表達量分別為1.00±0.00、0.25 ± 0.11、0.17 ± 0.05，siFTO-1 組、siFTO-2 組分別與 si-NC 組比較，P均＜0.05；Western blotting 法檢測結果顯示，si-NC 組、siFTO-1 組、siFTO-2 組 FTO 蛋白相對表達量分別為 1.02 ± 0.06、0.74 ± 0.13、0.64 ± 0.11，siFTO-1 組、siFTO-2 組分別與 si-NC 組比較，P均＜0.05；提示各組轉染成功。

1.3 SKOV3 細胞增殖率測算 采用CCK-8 法。轉染 24 h 后，胰酶消化收集“1.2”中 3 組 SKOV3 細胞，用高糖DMEM 培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，按100 μL/孔接種于96 孔板，每組均設置5個復孔，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養箱中培養；繼續培養24 h 后加入CCK-8 檢測試劑，10 μL/孔，在培養箱中孵育1 h，用酶標儀測定各孔450 nm 吸光度值（OD 值），并計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.4 SKOV3 細胞遷移率測算 采用細胞劃痕實驗。待“1.2”中3 組SKOV3 細胞生長融合度達到70%后，用無菌200 μL 移液槍頭垂直輕劃六孔板，PBS 洗滌2～3 次，每孔加入含2%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，分別于劃痕0、72 h 顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并拍照。采用Image J 軟件測量各組細胞劃痕間隙的距離，計算各組細胞的相對遷移率，細胞相對遷移率=1-72 h 劃痕間隙距離/0 h 劃痕間隙距離×100%。

1.5 SKOV3 細胞穿膜細胞數觀察 采用Transwell實驗。將低濃度基質膠（Matrigel）均勻鋪在Transwell 小室底部膜的上室面（50 μL/小室），放置培養箱中30 min 干燥后待用。轉染后24 h，胰蛋白酶消化收集“1.2”中3 組 SKOV3 細胞，用無血清的高糖DMEM 培養基重懸細胞，調整細胞濃度為4×105/mL，將200 μL 無血清重懸細胞液加小室的上部，小室的下腔加入1 000 μL 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養箱中孵育48 h，后以PBS 洗滌2 次，加入甲醇固定細胞30 min，用棉簽輕擦拭掉上室面細胞，下室面細胞使用5%結晶紫溶液進行染色2 h，PBS洗滌3次，在顯微鏡200倍視野下隨機拍攝5個視野計數穿膜細胞數，計算平均值。

1.6 SKOV3 細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量測算 采用Western blotting法。轉染48 h后，胰酶消化收集“1.2”中3組SKOV3細胞，加入 500 μL 的 NP-40 裂解液提取總蛋白，吹打后冰上靜置30 min，4 ℃環境下，以12 000 r/min的速度離心5 min，取上清；按BCA 蛋白定量試劑盒說明書操作進行蛋白濃度的檢測和蛋白定量，往定量后的上清液中加入loading buffer（上清液體積∶loading buffer 體積=4∶1），混勻后100 ℃加熱10 min使蛋白變性；配制10%SDS-PAGE 凝膠，各取20 μg總蛋白進行電泳，電泳條件：120 V 過濃縮膠至蛋白marker 分離清晰后，改160 V 直到溴酚藍跑至膠底；隨后進行轉膜至PVDF 膜，轉膜條件為250 mA、120 min；根據蛋白marker 和待檢測蛋白分子量進行剪膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，PBST 涮洗1 次后孵育對應一抗稀釋液4 ℃過夜（兔抗FTO 單克隆抗體1∶5 000，兔抗AKT 單克隆抗體1∶1 000，兔抗p-AKT單克隆抗體1∶1 000，兔抗PI3K 單克隆抗體1∶1 000，兔抗 p-PI3K 單克隆抗體 1∶1 000 和兔抗GAPDH 單克隆抗體 1∶5 000）；第 2 天 PBST 快洗 3次，慢洗3 次，每次15 min，常溫下孵育辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000）1 h，PBST 快洗3 次，慢洗3次，每次15 min，采用ECL試劑盒顯色，經曝光、顯影和定影后拍照；采用Image J 軟件分析各條帶的灰度值，計算各目的蛋白相對表達量并進行歸一化處理。各目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/對應GAPDH灰度值。

1.7 統計學方法 采用Graph Pad Prism 9.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數比較 細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數比較見表1。

表1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數比較（）

表1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數比較（）

注：與si-NC組比較，P＜0.05。

組別siFTO-1組siFTO-2組si-NC組細胞穿膜細胞數（個）110.80±27.40*134.60±25.15*31.20± 6.76細胞增殖率125.20%±8.24%*121.20%±5.42%*100.00%±0.00%細胞相對遷移率47.29%±11.05%*51.08%± 8.48%*29.15%± 1.92%

2.2 各組細胞 AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量比較 細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋 白 相 對 表 達 量 比 較見表2。

表2 各組細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量比較（）

表2 各組細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別siFTO-2組siFTO-1組si-NC組p-PI3K/PI3K 0.21±0.02*0.06±0.01*0.05±0.00 AKT 0.84±0.17 0.82±0.18 0.96±0.20 p-AKT/AKT 0.38±0.01*0.26±0.02*0.18±0.01 PI3K 1.04±0.08 1.08±0.08 1.00±0.08

3 討論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，也是世界上重要的公共衛生問題，嚴重影響患者的身心健康。根據全球癌癥統計數據顯示，2020 年全球卵巢癌新發約 31.4 萬例，卵巢癌死亡人數約 20.7 萬例［5］。根據2022 年最新發布的癌癥登記和隨訪監測數據顯示，2016 年卵巢癌新發病例約5.72 萬，卵巢癌死亡病例約2.72萬［6］。由于卵巢癌發病隱匿不易早期發現，患者被確診時往往處于晚期，患者常失去手術機會，而放化療治療效果不佳，近期和遠期預后不良［2］。人卵巢癌腺癌細胞系 SKOV3 由 TREMPE 和OLD 在1973 年從一位64 歲白人女性卵巢腺癌患者的腹腔積液分離得到，其能夠很好代表卵巢癌的生物特性。靶向分子治療具有更高的靶向選擇性和較高的治療效果，積極探討卵巢癌致病過程的分子機制，以期為卵巢癌的治療提供新的理論依據和有前途的靶點。FTO 作為m6A 去甲基化酶，主要與m6A甲基轉移酶共同調節體內m6A 水平，從而在人類生理和病理過程中發揮重要調控作用。近年多項研究顯示，FTO在惡性腫瘤發病過程主要發揮促癌作用，靶向 FTO 顯示出一定的治療效果［7-9］。但 FTO 也被報道在膀胱癌［10］、肝細胞癌［11］和卵巢癌［12］中發揮抑癌作用，但FTO 在卵巢癌中的表達和作用尚存在爭議。多篇文獻報道顯示FTO 在卵巢癌中的表達顯著下調［12-15］，但 ZHAO 等［16］發現 FTO 在人卵巢腫瘤組織中表達顯著上調。此外，FTO 能通過促進卵巢癌細胞增殖、抑制細胞凋亡、激活自噬過程，從而促進卵巢癌細胞的生長，發揮促癌作用［16］。然而另一項研究顯示，過表達FTO 抑制體外卵巢癌細胞的集落形成、球體形成、卵巢癌干細胞的增殖和自我更新，以及體內成瘤的生長，在卵巢癌中發揮抑癌作用［12］。而下調FTO 增強卵巢癌細胞對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑的耐藥性［13］。過表達FTO 能降低磷酸二酯酶4B 和磷酸二酯酶1C mRNA 中的m6A 水平和穩定性，上調環磷酸腺苷水平，增強環磷酸腺苷的信號轉導過程，最終抑制體內外卵巢癌的進展［12］。而下調FTO 可顯著增加卷曲蛋白10 mRNA 上的m6A 水平和穩定性，進而激活下游Wnt/β-catenin 信號通路，最終導致卵巢癌細胞對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑的耐藥性［13］。

腫瘤的惡性生物學行為涉及多方面，比如增殖、凋亡、遷移、侵襲、耐藥和腫瘤干細胞特性。為增加本實驗的可信度，本實驗設計合成序列不同的特異性靶向 FTO 的siRNA（siFTO-1 和 siFTO-2）進行平行重復試驗。本文結果顯示，與si-NC 組比較，siFTO-1組和siFTO-2 組細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著上調，說明干擾卵巢癌SKOV3細胞中FTO 的表達后可顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲能力，這提示FTO在卵巢癌中發揮抑癌作用。本文結果與HUANG等［12］和FUKUMOTO 等［13］研究結果一致，但與 ZHAO等［16］研究結果相反。FTO在卵巢癌中相矛盾的結果為后續的臨床應用和靶向藥物開發帶來一定的挑戰。在腫瘤治療中，基于小分子化合物靶向FTO 的策略不完全適用于卵巢癌的治療。相反，通過調節FTO內源性上下游效應分子間接促進FTO的表達或直接上調FTO 也可能是抑制卵巢癌進展的治療方法之一。FTO 在卵巢癌中發揮促癌或抑癌作用是FTO的本身功能多樣性，腫瘤微環境影響、亦或者是FTO 受時間和空間特異性影響，未來還需進一步研究和探索。

PI3K/AKT 信號通路是細胞周期過程中經典的細胞內信號通路，其上下游多種分子參與調節信號通路的激活過程，與細胞生理功能各個方面密切相關。PI3K 蛋白家族是一大類信號脂質激酶，能夠磷酸化質膜上磷脂酰肌醇的3′-OH 基團；AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是 PI3K 途徑的關鍵分子［17］。PI3K 活化磷酸化導致AKT 在細胞膜上的募集和活化，而活化的Akt 具有激活cAMP 反應元件結合蛋白、抑制p27、激活磷脂酰肌醇3-磷酸和和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等多種生物學功能，從而在許多細胞過程中起關鍵作用，包括葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、轉錄和細胞遷移［17-18］。PI3K/AKT 信號通路可被表皮生長因子、胰島素樣生長因子和鈣調素等多種生物分子所激活，但也能被第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和糖原合酶激酶3β 等其他分子所拮抗［18］。此外，PI3K/AKT 信號通路的異常激活也證實與多種惡性腫瘤的進展有關，靶向PI3K/AKT 信號通路及其上下游分子可能是抗腫瘤的有效手段［19］。本研究發現，與 si-NC 組比較，siFTO-1 組和 siFTO-2 組細胞中 PI3K、AKT 蛋白相對表達量無顯著變化，但p-AKT/AKT 和P-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量顯著升高，提示干擾FTO 可顯著激活SKOV3 細胞中 PI3K/AKT 信號通路，表明 FTO 對卵巢癌細胞中PI3K/AKT 信號通路具有負性調控作用，本文結果不同于ZHAO 等［16］的研究報道，即FTO能促進卵巢癌細胞中AKT 的磷酸化過程。以上結論提示，上調FTO 表達間接抑制PI3K/AKT 信號通路將會為卵巢癌的治療提供新的治療策略和思路。

總之，干擾FTO 可顯著促進卵巢癌SKOV3 細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能是通過上調PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，進而激活 PI3K/AKT 信號通路。