回旋灸對Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠創面愈合和血清炎癥因子的影響

武曉林,尤 敏王 婷，楊 敏，樊雅玲，童勤思,

1.安徽中醫藥大學護理學院,安徽230000；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院

Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷(pressure injury,PI)是一種常見的慢性難愈性傷口。慢性難愈性傷口是指(hard-to-heal wounds)任何在經過4周標準化護理后仍未愈合40%～50%的傷口[1]。調查顯示伴隨感染的壓力性損傷是65歲以上病人死亡的獨立預測因子[2]。炎癥反應期是創面愈合過程重要的階段,對創面愈合起著關鍵的作用。細胞及細胞因子分泌紊亂,會導致創面停滯在炎癥反應階段,而過多且持續的炎癥反應會加速創面惡化[3-4]。因此,控制炎癥反應對Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷的治療具有重要的臨床意義。葉廣祚提倡治瘡瘍宜早,且不論陰證陽證,新證久證,有膿無膿,膿深膿淺,皆宜用灸[5]。回旋灸可以溫經通絡、散寒通滯、促進血液循環[6]。艾灸治療壓力性損傷的有效性已經得到很多研究的證實[7-9],但關于其機制的研究仍需進一步探索。因此，本研究采用磁鐵壓力法復制Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型,利用病理學、免疫學等手段,觀察Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠創面愈合率、組織病理形態、血清白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素4(IL-4)表達,探討回旋灸治療Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠的可能機制,為臨床治療壓力性損傷提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

樣本量計算依據每組大鼠樣本量一般為6～12只[10]，本研究在保證實驗數據可靠性前提下，依據動物實驗的3R原則，確定樣本為32只，每組8只大鼠。選取6～8周無特定病原體(SPF)級健康雌性SD大鼠32只,重量180～200 g,購自安徽醫科大學實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(皖)2017-001,大鼠合格證編號:SCXK(豫)2019-0002。動物飼養于安徽中醫藥大學動物實驗室,室溫22～27 ℃,相對濕度40%～60%,12 h/12 h明暗周期,大鼠自由攝食、進水,適應性飼養1周后開始實驗。采用隨機數字表法分為空白組、模型組、常規治療組和艾灸組,每組8只,后3組大鼠采用磁鐵加壓法復制Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型。各組體重比較,差異無統計學意義(P>0.05)。實驗過程嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器(見表1)

表1 主要儀器

1.2.2 試劑(見表2)

表2 主要試劑

1.3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠模型

1.3.1 模型制備

采用磁鐵壓力法[11]復制大鼠壓力性損傷模型。大鼠禁食、禁水8 h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(每100 g體重0.2 mL)進行麻醉。在大鼠背部正中線左側臀部備皮,范圍為2 cm×2 cm。手術區操作臺鋪一次性無菌手術巾,僅暴露大鼠手術區,用5%聚維酮碘消毒后,切一2 cm的切口,用鑷子將筋膜和組織鈍性分離,直至肌肉暴露,將高壓滅菌后的鐵片(直徑2 cm,東莞市昶高磁電制品有限公司)放置于肌肉下,使用手術縫線以單純間斷縫合的方式縫合切口,再用5%聚維酮碘消毒縫合處以防止感染發生。造模后第2天開始,利用體內外磁鐵相吸向大鼠進行施壓,施壓2 h,解除壓力0.5 h,每天進行5個循環,連續造模4 d。第5天評估傷口分期后開始換藥,共換藥9 d。大鼠單籠飼養,供給充足食物和水,及時更換墊料。

1.3.2 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型制備成功的判斷標準[12]

Ⅲ期:受壓處皮膚黑硬,針刺后不出血,皮膚清創后暴露脂肪但不暴露肌肉、肌腱或是骨骼;Ⅳ期:邊緣皮膚紅腫糜爛,有滲液或滲血,伴有骨骼、肌腱或肌肉暴露。

1.4 干預方法

1.4.1 傷口床準備

依據TIME原則實施干預措施。即tissue(組織評估和管理)、inflammation and infection(感染/炎癥管理)、moisture balance(濕度平衡/管理)、edge(傷口邊緣觀察和管理)[1]。

1.4.1.1 評估傷口(T)

觀察創面顏色,測量傷口大小、深度、潛行、竇道,觀察滲液的量、顏色、性質、氣味,以及傷口肉芽的顏色、周圍皮膚顏色、有無腫脹、內卷等方面。

1.4.1.2 清除壞死組織,控制感染(I)

非感染性傷口:使用0.5%碘伏消毒創面周圍皮膚后用生理鹽水清洗創面,將創面壞死組織、分泌物及原來的殘留藥物清洗干凈,再用生理鹽水反復多次沖洗創面,無菌干紗布吸干創面水分;感染性傷口:感染傷口局部表現為組織塌陷、紅腫加重、分泌物增多,滲出液渾濁黏稠,氣味改變,肉芽脆弱[13]。使用0.5%碘伏消毒創面周圍皮膚及由外向內消毒創面,將創面壞死組織、分泌物及原來的殘留藥物清洗干凈,再用生理鹽水反復多次沖洗創面,無菌干紗布吸干創面水分。消毒過程嚴格遵循無菌技術操作原則。

1.4.1.3 濕度平衡(M)

維持室內相對濕度40%～60%,維持創面濕度平衡。傷口滲出液過多時,采用凡士林紗布條引流滲出液;傷口過干時,使用經高溫消毒的生理鹽水紗布覆蓋傷口。

1.4.1.4 觀察傷口邊緣情況(E)

傷口邊緣游離:填塞敷料;傷口邊卷:外科切除;使用生理鹽水清洗并用無菌干紗布擦干周邊皮膚受損部位,保護傷口邊緣皮膚。

1.4.2 分組護理

空白組進行常規飼養。模型組:傷口床準備好后使用經高壓滅菌的生理鹽水紗布進行換藥,每天1次,9 d為1個療程。常規治療組:傷口床準備好后使用藻酸鹽銀離子敷料(嘉興騰昇醫療器械有限公司)[14]進行換藥,每天1次,9 d為1個療程。艾灸組:傷口床準備好后將艾條(南陽艾之靈艾業有限公司)燃燒端距傷口表面3 cm進行施灸,傷口表面反復旋轉移動,每天15 min。使用醫用紅外線電子體溫溫度計記錄大鼠創面表皮溫度,使溫度維持在41～43 ℃。施灸過程中及時處理艾灰,避免艾灰接觸大鼠創面后燙傷或者感染創面等導致傷口惡化。回旋灸治療后使用生理鹽水敷料覆蓋傷口。每天1次,9 d為個療程。

1.4.3 標本采集

于實驗干預第10天留取標本,大鼠稱重,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(每100 g體重0.2 mL)麻醉大鼠后,取大鼠腹主動脈血和創面組織,最后采用斷頸法處死大鼠。

1.5 觀察指標

1.5.1 創面愈合率

使用創面愈合率評估大鼠創面愈合情況。于第1天、第3天、第5天、第7天、第9天測量模型組、常規治療組和艾灸組大鼠的創面面積。使用經消毒的硫酸紙(105 mm×148 mm)描出創面邊緣后,在硫酸紙底部放一量尺后拍照。將照片導入Image-Pro Plus,測量創面面積。第n天創面愈合率=(第1天創面面積-第n天創面面積)/第1天創面面積×100%。

1.5.2 創面病理學組織形態

采用蘇木素-伊紅(HE)染色，于換藥第10天。取大鼠創面組織。烤片20～30 min，二甲苯5 min,乙醇(100%、95%、80%)脫水3次,每次3 min,流水緩慢沖洗,蘇木素浸染2～5 min,1%鹽酸乙醇分化數秒,飽和碳酸鋰溶液藍化數秒,95%乙醇脫水2 min,伊紅染液(醇溶性)浸染數秒,95%乙醇,每次5～10 s,100%乙醇脫水2次,每次1 min,苯酚-二甲苯、二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明2次,每次2 min。封片后置光學顯微鏡下(×400)觀察。

1.5.3 血清炎性因子水平表達(IL-4、IL-6、IL-1β)

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，在大鼠換藥第10天,抽取大鼠腹主動脈血,稀釋、加樣，加酶標試劑50 μL,37 ℃溫育30 min,配液、洗滌，依次加入顯色劑A和B各50 μL,37 ℃避光顯色10 min,加終止液50 μL,終止反應,測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠造模前體重及造模情況

造模前4組體重比較差異無統計學意義。飲食、飲水及大小便均正常。各組壓力性損傷情況：模型組2只大鼠Ⅲ期，6只大鼠處于Ⅳ期；常規治療組1只大鼠處于Ⅲ期，7只大鼠處于Ⅳ期；艾灸組2只大鼠處于Ⅲ期，6只大鼠處于Ⅳ期。模型組于換藥第1天和第2天各死亡1只大鼠,予以剔除。換藥前各組大鼠創面面積比較見表3。

表3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠一般資料比較

2.2 創面愈合率

第3天,3組大鼠創面愈合率比較,差異均無統計學意義(P>0.05);第5天、第7天、第9天,艾灸組創面愈合率均優于同組第3天創面愈合率,也優于同期模型組和常規治療組,差異均有統計學意義(P<0.05),而模型組與常規治療組創面愈合率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠創面愈合率比較 單位:%

2.3 創面病理學組織形態變化

創面組織病理學觀察詳見圖1,模型組真皮層大面積壞死溶解,肌纖維壞死,大量炎性細胞浸潤,未見毛囊等附屬器官;常規治療組可見較多炎性細胞浸潤,有新生血管形成;艾灸組較少炎性細胞浸潤,可見肌纖維和新生血管形成。

圖1 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠創面組織病理學觀察

2.4 血清IL-4、IL-6、IL-1β表達水平(見表5)

表5 各組壓力性損傷模型大鼠血清IL-4、IL-6、IL-1β表達水平比較 單位:pg/mL

3 討論

3.1 大鼠創面愈合和病理情況比較

傷口表面面積的減少是傷口恢復進展的標志[1]。本研究結果顯示回旋灸干預可以顯著提高創面的愈合。這與成育玲等[15]研究結果相似。

3.2 大鼠炎性因子表達的比較

3.2.1 IL-1β在Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠的表達

M1型促炎性巨噬細胞和M2型抗炎性巨噬細胞是巨噬細胞的兩種表型[16-17],在不同階段動態轉化[18],可以分泌大量的炎癥因子,是創面組織修復中的關鍵細胞。IL-1β是M1型抗炎性巨噬細胞分泌的一種促炎細胞因子[19],參與炎性反應,誘導細胞外基質的降解,有助于清除傷口殘留及感染物質[20],但其過度表達會使炎癥反應失控而導致組織損傷。本研究結果顯示在艾灸組大鼠血清IL-1β的表達水平為(55.51±3.29)pg/mL,明顯低于模型組(118.41±2.96)pg/mL和常規治療組(82.26±3.31)pg/mL,差異具有統計學意義(P<0.05)。說明回旋灸抑制大鼠IL-1β的表達,減輕IL-1β過度表達引起的炎癥反應,減輕組織損傷。與闞宇[21]的研究結果不同,可能是由于其研究的為炎癥期炎癥因子的表達水平,提示艾灸可以促進炎癥期促炎因子的表達;而本實驗第10天模型組IL-1β的高表達提示炎癥因子的失調導致創面停滯在炎癥期導致愈合延遲,結果提示回旋灸干預可以抑制過度的炎癥反應,促進傷口愈合過程由炎癥期向增殖期的過度。

3.2.2 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠IL-6的表達

IL-6在慢性傷口的表達水平高于急性傷口[22],IL-6高表達會加重炎癥反應程度。蘭園淞等[23]發現壓力性損傷模型大鼠血清IL-6的表達水平明顯升高。本研究結果顯示常規治療組和艾灸組大鼠血清IL-6的表達水平分別為(92.47±4.14)pg/mL、(110.07±4.31)pg/mL,明顯低于模型組(175.00±3.72)pg/mL(P<0.05)。提示回旋灸可以抑制IL-6的表達,減輕炎癥反應過度對組織造成的損害。這與李杰輝等[24]的研究結果一致。銀離子(Ag+)除具有抗菌活性外,還具有抗炎作用,可以有效控制壓力性損傷傷口感染時間,促進傷口愈合[25]。本實驗發現藻酸鹽銀離子敷料可以通過促進IL-4、抑制IL-6和IL-1β的表達來發揮其抗炎作用，且抑制IL-6表達的效果優于艾灸組。

3.2.3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠IL-4的表達

IL-4是最有效的抗炎細胞因子之一[26]。創面正常愈合后期,M2型巨噬細胞在IL-4和IL-13的刺激下,分泌IL-4、IL-10、IL-12 等抗炎因子和生長因子IGF-1、VEGF、TGF等[27],可以抑制炎癥反應，誘導血管再生，重塑組織。而存在慢性難愈性創面的機體,M1巨噬細胞持續存在,導致巨噬細胞無法轉換為M2表型,創面促炎細胞因子水平持續升高,而M2巨噬細胞的抗炎及組織修復功能難以發揮,兩種表型巨噬細胞的失調導致其分泌的抗炎因子和促炎因子的平衡失調,因此傷口進程往往會停滯[28]。本研究結果顯示艾灸組大鼠血清IL-4的表達水平為(181.29±6.97)pg/mL,明顯高于模型組(68.80±7.28)pg/mL和常規治療組(152.12±7.48)pg/mL(P<0.05)，提示回旋灸可以促進IL-4的表達,抑制炎癥反應。

4 小結

機體處于微炎癥狀態下,促炎因子大量分泌而抗炎因子分泌不足,使得炎癥因子之間的平衡失調,導致傷口愈合延遲[29]。回旋灸干預可以減輕創面炎癥反應,促進創面愈合[30]。從上述結果中得出,回旋灸通過促進抗炎因子IL-4的表達,抑制促炎因子IL-1β、IL-6的表達,從而達到促炎因子和抗炎因子之間的平衡,以抑制炎癥反應進而促進創面愈合。故臨床可以考慮在常規治療的基礎上使用回旋灸輔助治療慢性難愈性創面。本研究探討關于回旋灸對創面炎癥的觀察,今后需進一步探討回旋灸在分子生物學方面的機制研究。