HBV 相關肝硬化腹水患者的腸道微生態特征與中醫證型的關系

莫小艾 蔣開平 馬曉軍 任健 江群芳 黃凱舟 謝悠青

肝硬化失代償期具有并發癥多、病死率高、預后差的特點,如不及時診治將會迅速發展為自發性腹膜炎、肝腎綜合征、消化道出血等,病死率高達50%［1］。乙型肝炎病毒(hepatitis bvirus,HBV)感染是引起肝硬化的主要原因,腹水是肝硬化失代償期最常見的失代償形式,發病機制與門靜脈高壓、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)活性增強、淋巴回流受阻、低蛋白血癥、其他血管活性物質增多或活性增強等有關［2］。肝硬化腹水發病機制的研究以及新的治療方法的探索有助于改善患者的生活質量和預后,且腹水極度容易發生自發性腹膜炎,肝硬化發展成失代償期后,患者的生存率大大降低,治療費用也明顯增加。如及時有效治療,可防治肝硬化發展成失代償期,故早期干預治療至關重要。目前西醫的治療主要圍繞在利尿、護肝、補充白蛋白等綜合治療,費用昂貴,針對部分難治性腹水療效欠佳。多項研究表明中藥可以通過調節腸道菌群的種類和數量,使腸道菌群的總體功能發生改變,進而影響疾病的預后［3,4］。因此,在常規西醫綜合治療的基礎上,干預與調節腸道菌群的失調,對于提高肝硬化的治療尤其重要,中西醫結合治療在臨床上已廣泛應用,且療效顯著。本研究通過觀察HBV 相關肝硬化腹水患者、HBV 相關肝硬化代償期患者的腸道微生態,找HBV 相關肝硬化腸道菌群變化的靶點,從腸道微生態角度研究肝硬化由代償期發展成失代償期的發病機制。研究不同中醫證型的HBV 相關肝硬化腹水患者的腸道微生態特點,為中醫中藥辨證施治治療HBV 相關肝硬化腹水的臨床療效提供依據,對逐步建立該病的中醫證候分型中醫藥規范治療有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年6 月～2022 年3 月在本院住院的HBV 相關肝硬化腹水患者30 例(肝硬化腹水組)和肝硬化代償期患者30 例(肝硬化組),患者入組前均簽署知情同意書,研究方案經佛山市中醫院倫理委員會批準。肝硬化腹水患者中男22 例,女8 例；年齡30～72 歲,平均年齡(56.18±13.42)歲。肝硬化代償期患者中男20 例,女10 例；年齡25～65 歲,平均年齡(48.55±13.42)歲。根據中醫證候分型將HBV 相關肝硬化腹水患者分為濕熱水停組(12 例)、血瘀水停 組(5 例)、陽虛水停組(8 例)、陰虛水停組(5 例)。

1.2 診斷標準 ①西醫診斷按中華醫學會肝病學分會發布《2017 年肝硬化腹水及相關并發癥的診療指南》及《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年)》的診斷標準；②運用中醫舌面信息采集系統及脈象采集體質辨識系統規范(中醫四診診斷儀)采集證侯信息,以中華中醫藥學會脾胃病分會發布《2017 年肝硬化腹水中醫診療規范專家共識意見》中醫證候診斷標準對患者進行中醫證候分型。

1.3 納入標準 ①同時符合西醫及中醫相關診斷標準的患者；②自愿參加本研究并簽署知情同意書者；③年齡16～80 歲；④獲得患者知情同意后留取大便和血標本,所有患者在采樣前2 周內均未接受過抗生素治療。

1.4 排除標準 ①除乙型肝炎病毒感染引起肝硬化患者；②肝硬化合并消化道出血、肝性腦病患者；③合并惡性腫瘤的患者；④治療前2 周服用抑酸藥、促胃腸動力藥、微生態制劑、抗生素等；⑤可能引起腸道菌群失調的其他疾病；⑥妊娠期以及哺乳期婦女。

1.5 研究方法 檢測并比較肝硬化組和肝硬化腹水組患者肝的FibroScan 測量值、ICGR15 值、腸道菌群,肝硬化腹水組不同中醫證型患者腸道菌群。①檢測患者糞便中腸道菌群結構變化。采集研究對象清晨新鮮糞便樣本,每個樣本需200～220 mg,放入冰箱后轉運至實驗室進行分裝處理,為防止腸道菌群DNA 降解,糞便采集到標本轉移至-80℃冰箱凍存,控制在30 min內完成。取患者的糞便按梯度稀釋后進行選擇性培養,使用微生物鑒定系統檢測每克單位的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的菌落數。②FibroScan 測量值：采用法國巴黎Echosens 公司FiborScan502 儀器,檢測方法參照FiborScan502 用戶手冊,由專業培訓的操作者獨立完成。檢測區域為右側腋前線至腋中線第7、8、9 肋間,連續成功檢測10 次,取中位值(M)為最后測定結果,并以測量值(kPa)表示。③ICGR15 值：采用肝儲備功能測試儀,受檢者無碘過敏史,患者空腹 8～12 h,平臥位,鼻感探頭連接鼻翼,肘正中靜脈注射吲哚菁綠,應用軟件按身高、體重、血紅蛋白計算計量,檢測肝臟對吲哚菁綠的排出情況,得出吲哚菁綠的清除率和滯留率。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0 統計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝硬化組和肝硬化腹水組患者肝的FibroScan測量值比較 肝硬化腹水組肝的FibroScan 測量值(45.25±10.63)kPa 明顯高于肝硬化組的(14.27± 9.95)kPa,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 肝硬化組和肝硬化腹水組患者肝的FibroScan 測量值 比較(±s,kPa)

表1 肝硬化組和肝硬化腹水組患者肝的FibroScan 測量值 比較(±s,kPa)

注：與肝硬化組比較,aP＜0.05

2.2 肝硬化組和肝硬化腹水組患者ICGR15 值比較 肝硬化腹水組的ICGR15 值(37.47±8.25)%明顯高于肝硬化組的(8.56±5.28)%,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 肝硬化組和肝硬化腹水組患者ICGR15 值 比較(±s,%)

表2 肝硬化組和肝硬化腹水組患者ICGR15 值 比較(±s,%)

注：與肝硬化組比較,aP＜0.05

2.3 肝硬化組和肝硬化腹水組患者腸道菌群比較 肝硬化腹水組患者雙歧桿菌數量明顯少于肝硬化組,腸桿菌數量明顯多于肝硬化組,差異具有統計學意義(P＜0.05)；肝硬化組和肝硬化腹水組的腸球菌、乳酸桿菌數量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 肝硬化組和肝硬化腹水組患者腸道菌群比較(±s,lgCFU/g)

表3 肝硬化組和肝硬化腹水組患者腸道菌群比較(±s,lgCFU/g)

注：與肝硬化組比較,aP＜0.05

2.4 肝硬化腹水組不同中醫證型患者腸道菌群比較 濕熱水停組患者的腸桿菌數量多于血瘀水停組、陽虛水停組、陰虛水停組,差異具有統計學意義(P＜0.05)；四組的腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數量比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4 肝硬化腹水組不同中醫證型患者腸道菌群比較(±s,lgCFU/g)

表4 肝硬化腹水組不同中醫證型患者腸道菌群比較(±s,lgCFU/g)

注：與其他組比較,aP＜0.05

3 討論

肝硬化是由多種原因引起的以肝細胞廣泛變形壞死、肝纖維結締組織增生、再生結節和假小葉形成為主要病理特征的肝臟的慢性、進行性、彌漫性病變。腹水的出現是肝硬化由代償期轉為失代償期的一個重要標志,新發肝硬化患者10 年內腹水的發生率高達50%～70%［5］。肝硬化腹水患者經治療使腹水消退后,肝硬化失代償期可轉變為代償期,定義為肝硬化再代償。故研究肝硬化由代償期發展成失代償期的機制,找到其靶點,減少肝硬化代償期向失代償期進展,成為肝硬化患者治療的新方向。

肝臟與腸道微生物通過“腸-肝軸”相互聯系,肝臟通過門靜脈接受來自于腸道的血液和腸道微生物以及相關的代謝產物,反過來肝臟分泌膽汁經過膽道系統進入腸道,進而維持腸道微生態的平衡,在肝臟中產生的膽汁酸來自腸道細菌的酶代謝,并且對于維持健康的腸道微生物起重要作用［6］。大量實驗研究表明,肝病的發生、發展與人體腸道微生態的變化密切,腸道菌群失調是其發生和發展的重要機制之一［7］。研究顯示,肝硬化腹水患者存在腸道細菌過度生長和腸道細菌易位等腸道微生態環境異常的病理改變,再加上機體免疫力差和抵抗力低,導致腸道微生態失衡,且失衡程度與病情的嚴重程度相關,增加了患者死亡 風險［8,9］。由此可見,分析肝硬化腹水的腸道微生態狀態不僅有利于評估患者預后,而且為臨床治療提供了參考。

肝纖維化掃描是評估肝臟纖維化程度的指標,準確性較高,在臨床上廣泛應用,被多項臨床指南納入評估肝臟硬度的重要指標［10］。吲哚菁綠清除試驗是評估有效肝儲備功能的指標,相較于傳統的Child-pugh 評分系統更敏感,有利于早期警示肝功能不全和判斷病情輕重［11］。本研究所示,肝硬化腹水組患者的肝纖維化掃描及肝儲備結果均較肝硬化組患者嚴重,提示入組的病例在病情上符合病情程度的差異性。肝硬化腹水患者的有益菌明顯較肝硬化患者少,致病菌較肝硬化組多,這與上述的臨床研究結果相符,隨著肝臟疾病的進展,腸道菌群失調情況越發嚴重,調整腸道菌群的結構,將有利于控制疾病的進展。

肝硬化腹水屬于中醫“鼓脹”范疇,其病位主要在肝脾腎,病性本虛標實,辨治從氣、血、水入手,同時還應辨清濕、熱、虛、實,中醫分型為氣滯水停證、濕熱水停證、脾虛水停證、血瘀水停證、肝腎陰虛水停證、脾腎陽虛水停證［12］。HBV 為嗜肝病毒,病位在肝,所謂“見肝之病知肝傳脾”,飲食水谷的消化吸收有賴脾升胃降與肝之疏泄共同作用,水谷精微才可輸布全身起作用,所謂“土得木而達”,若肝之疏泄失職必會影響膽汁的疏泄和脾之運化升清的功能,胃腸道的受盛化物功能受損,從而出現惡心、納差、腹脹、腹瀉等胃腸道癥狀［13］。《醫學入門》曰：“肝與大腸相通(肝病宜疏通大腸,大腸病宜平肝經為主)；脾與小腸相通(脾病宜瀉小腸火,小腸病宜潤脾土為主) ”。腸道與肝脾相通,所以,無論是肝之疏泄失職,還是脾胃升降失調,均直接影響腸道功能,腸道菌群定植于人體的胃腸道,所以肝病易引起腸道菌群的失調。飲食之物必經過胃腸道,而正常的腸道細菌可促進人體消化作用,正常的腸道細菌則為消化功能“游溢精氣”之始,為后天正氣的來源之部位,若腸道菌群失調,消化吸收受影響即脾運失職,濁邪內生,阻滯氣機,肝疏泄之能受阻,引起肝臟病變,所以腸道菌群的失調,反過來也會引起肝臟疾病［14］。研究顯示,如補益類中藥如黨參、人參、黨參、黃芪等會促進腸道內某些益生菌的生長、繁殖,而清熱類中藥如金銀花、黃連、連翹、穿心蓮、蒲公英等能抑制一些有害菌的生長、繁殖［15-17］。同時腸道微生物可通過還原反應、水解反應等方式對中藥進行代謝轉化,再被人體吸收從而達到治療效果,因此腸道菌群與中藥的藥效關系存在密切聯系。

中醫證候是中醫關于在人體在疾病狀態下信息的綜合征象,但是目前中醫證候診斷并沒有統一的標準,雖然有針對血清生化、免疫、病毒等為代表的中醫證候生物學基礎的研究,但是這類檢測并不能精確地反映中醫證候基礎的本質,而最能反映中醫證候本質的代謝組學、腸道微生態的研究相對較少,所以中醫證候的標準化與規范化研究一直是中醫研究領域的重點和難點。近年來,腸道微生態與慢性肝病的研究受到了醫學界的高度關注,隨著研究的深入發現腸道微生態系統與肝臟在生理功能及解剖結構上緊密相關,而腸道微生態的改變與慢性肝病的發生、發展也有著密切的聯系,此外中醫藥在失調的腸道菌群的恢復起著相當重要的作用,因此圍繞腸道微生態開展中醫證候學研究可為中醫證候研究提供嶄新視角和研究領域。

本研究納入的30 例肝硬化腹水患者分4 種證型作比較,因病例數較少,其中辨證分型無氣滯水停患者,脾虛水停患者因大多出現脾腎陽虛,故納入陽虛水停組。經研究發現,只有濕熱水停組患者的腸桿菌較其他組多,出現有害菌增多情況,故考慮濕熱證患者可能較其他證型更有特征性的腸道菌群失調。這與趙瑜等［18］的臨床研究濕熱證具有特征性腸道微生態觀點一致。因納入病例數少,且較多證型存在合并證型情況,如濕熱水停患者也合并有血瘀情況,故分型分組的時候,也可能存在重疊證型的情況,這給分組帶來了困難,且容易影響了研究結果。

肝硬化腹水為世界性的治療難題,目前中醫在肝硬化腹水的診療越來越受重視,肝硬化腹水的中醫證候研究也較多,但沒有統一的辨證標準,而基于生物學基礎研究的血清生化、免疫、病毒等研究,雖然可間接反映中醫證候演變規律,但是均不能從本質上闡釋中醫證候的科學內涵,這些都導致了中醫辨證及組方用藥的精準化、規范化發展受限。此外最能反映中醫證候本質的蛋白組學、代謝組學、腸道微生態的研究相對較少,尤其腸道微生態作為近幾年的研究熱點,圍繞腸道微生態深入開展中醫證候學研究及方證相關研究更可為肝硬化腹水中醫證候研究提供了嶄新視角,為肝硬化腹水中醫證候基礎的生物信息數據及精準醫療的深入發展提供了重要依據。