小麥主要品質相關基因的分子檢測與分析

孫華衛(wèi)，凌 冬，張道榮，唐 清，周芳菊，湯清益，劉先斌，王志順，湯三明，任喜峰

（1.襄陽市農業(yè)科學院糧食作物研究所，湖北 襄陽 441057；2.湖北洪山實驗室，武漢 430070）

1B/1R易位系是指小麥的1B染色體短臂被黑麥的1R染色體短臂取代而形成的小麥-黑麥易位系［1］。通常帶有來自黑麥的抗條銹基因Yr9、抗葉銹基因Lr26、抗稈銹基因Sr31和抗白粉病基因Pm8，同時具有較好的豐產性和適應性，因此在國內外小麥育種中得到廣泛應用，然而隨著各種病理小種的突變和發(fā)展，多數(shù)1B/1R易位系已經失去原有的抗性，同時1B/1R易位系還會帶來面粉面團黏性增大、強度降低、烘烤品質變劣等問題［2-4］。

小麥子粒蛋白質主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，麥谷蛋白占面筋蛋白的35%左右，主要由高分子量谷蛋白亞基（GMW-GS）和低分子量谷蛋白亞基（LMW-GS）組成，其中高分子量谷蛋白亞基對面筋特性起著重要的作用，與小麥烘焙品質密切相關，對品質性狀具有決定性的作用［5］。高分子量谷蛋白亞基基因中的Dx5和Dy10是所有亞基基因中對烘焙品質貢獻最大的基因，同時它們是一對緊密連鎖的基因［6］。本研究主要對高分子量谷蛋白亞基中的Ax2*、AxN、Bx7、By8、Dx5和Dy10基因進行分子標記的檢測。小麥子粒中的多酚氧化酶所催化的化學反應是導致面制品酶促褐變的主要原因，其活性和面制品色澤褐變有密切的關系［7］。多酚氧化酶主效基因主要是位于染色體2AL和2DL上的Ppo-A1和Ppo-D1，Ppo-A1等位基因包括Ppo-A1a（高PPO活性）和Ppo-A1b（低PPO活性），Ppo-D1等位基因包括Ppo-D1a（低PPO活性）和Ppo-D1b（高PPO活性）［8］。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為挑選的農藝性狀和品質相對較好的88份小麥親本材料，均來自襄陽市農業(yè)科學院小麥課題組，所有材料田間表現(xiàn)性狀一致。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 材料種植于襄陽市農業(yè)科學院團山鎮(zhèn)小麥試驗地，在小麥幼苗期，取少量葉片于2 mL的離心管中，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，詳細步驟參考文獻［9］。

1.2.2 PCR擴增及分子標記檢測 試驗相關分子標記見表1。PCR反應體系為10 μL，含有2×SanTaqPCR Mix預混液5 μL（生工生物工程（上海）股份有限公司）、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、10～50 ng DNA模板1 μL、滅菌去離子水3.2 μL。

表1 分子標記引物標記序列、預期擴增條帶大小及對應的等位變異類型

2 結果與分析

2.1 1B/1R易位系檢測結果

標記1B/1R在含有1B/1R異位系的材料中能夠擴增出1 500 bp的片段（圖1a）。結果顯示，在88份親本材料中有19份材料含有1B/1R異位系，占總數(shù)的21.59%。

2.2 高分子量谷蛋白亞基檢測結果

Ax2*標記在含有Ax2*基因的材料中能夠擴增出1條1 319 bp的條帶（圖2a），AxN標記在含有AxN基因的材料中能夠擴增出1條920 bp的條帶（圖2b），標記By8在含有亞基By8的品種中可擴增出527 bp的片段（圖1b），標記Bx7在含有亞基Bx7的品種中可擴增出630 bp或766 bp的片段（圖3），Dx5標記能夠在含有5+10亞基的材料中擴增出450 bp的片段（圖4）。

圖1 標記1B/1R（a）和By8（b）擴增部分試驗材料瓊脂糖凝膠電泳

圖3 標記Bx7擴增部分試驗材料瓊脂糖凝膠電泳

圖4 標記Dx5擴增部分試驗材料瓊脂糖凝膠電泳

在88份親本材料中，含有亞基Ax2*、AxN、Bx7、By8和Dx5的品種分別有4、51、81、31和38份，分別占總數(shù)的4.55%、57.95%、92.05%、35.23%和43.18%。

2.3 多酚氧化酶基因檢測結果

控制多酚氧化酶活性的基因檢測主要使用的標記是PPO18和PPO29，能夠分別檢測2A和2D染色體上PPO等位基因。標記PPO18在含有Ppo-A1a（高PPO活性）基因的材料中能夠擴增出685 bp的片段（圖5），在含有Ppo-A1b（低PPO活性）基因的材料中能夠擴增出876 bp的片段（圖5）。標記PPO29在含有Ppo-D1a（低PPO活性）基因的材料中沒有擴增產物（圖2c），在含有Ppo-D1b（高PPO活性）基因的材料中能夠擴增出490 bp的片段（圖2c）。

圖2 標記Ax2*（a）、AxN（b）、PPO29（c）擴增部分試驗材料瓊脂糖凝膠電泳

圖5 標記PPO18擴增部分試驗材料瓊脂糖凝膠電泳

在88份親本材料中，Ppo-A1a和Ppo-A1b基因型分別為40份和48份，頻率分別為45.45%和54.55%（表2）。Ppo-D1a和Ppo-D1b基因型分別為49份和39份，頻率分別為55.68%和44.32%。基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有29份，頻率為32.95%，基因型Ppo-A1a/Ppo-D1a（中等PPO）和Ppo-A1b/Ppo-D1b（中等PPO）的材料分別有20份和19份，頻率分別為22.73%和21.59%。基因型Ppo-A1a/Ppo-D1b（雙高PPO）的材料有20份，頻率為22.73%。

表2 供試小麥品種品質基因的分子標記檢測結果

2.4 含有多個優(yōu)質基因親本篩選結果

88份親本材料中，含有1、7+8、5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有2份，分別為鄭麥119和鄭麥578，頻率為2.27%。含有N、7+8、5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有1份，為藁優(yōu)5766，頻率為1.14%。含有5+10亞基，非1B/1R異位系和基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料有9份，分別為黃203、貴農19、鄭麥119、SW18390、中麥1139、中梁96289、信麥28、鄭麥578和藁優(yōu)5766，頻率為10.23%。同時含有5+10亞基和非1B/1R異位系有31份親本，頻率為35.23%。含有低PPO活性基因的材料能夠改善面制品的色澤，含有5+10亞基和非1B/1R異位系的材料能夠提高面筋質量，提高烘焙品質，聚合多個優(yōu)質基因的材料能夠有效地提高面粉的品質。

3 討論

3.1 分子標記檢測的實用性

相比于SDS-PAGE檢測法，分子標記檢測具有準確率高、工作量小、周期短等優(yōu)點。SDS-PAGE檢測法是根據(jù)高分子量谷蛋白亞基在SDS-PAGE凝膠上的遷移率來區(qū)分不同亞基的，不同亞基在凝膠上的遷移率并不總能與分子量一致［10］，會導致相應的誤差。而分子標記檢測是對遺傳物質進行檢測，準確率高，效果好。SDS-PAGE檢測方法只能用小麥子粒進行檢測，而分子標記檢測能夠取材于植株的大部分時期和部位，不受發(fā)育時期的限制［11］。通過分子標記輔助選擇技術能夠加快優(yōu)質強筋小麥的育種進程，提高選擇效率。

續(xù)表2

3.2 品質基因分布及其運用

不同組合的高分子量谷蛋白亞基對面團強度和烘焙品質的貢獻率不同：Glu-A1位點1>2*>N；Glu-B1位點7+8>13+16>17+18=7+9；Glu-D1位點5+10>2+12>4+12［12］。在88份親本材料中，亞基Ax2*的頻率為4.55%。Ax2*亞基是稀有優(yōu)質亞基，在中國普通小麥中分布較少，2019年郝浩楠［13］檢測了294份中國核心小麥種質資源，Ax2*亞基的分布頻率為3.68%，略低于本研究中Ax2*亞基的分布頻率。說明挑選的親本材料Ax2*亞基的分布頻率可觀，可加以利用。2015年陳泠等［14］對審定的127份品種進行了高分子量谷蛋白亞基組成分析，亞基7+8的分布頻率是44.09%，亞基5+10的分布頻率是29.92%。本研究中亞基7+8的分布頻率是34.09%，亞基5+10的分布頻率是43.18%，亞基5+10比例有所提高。亞基組合1/2*、7+8、5+10的材料有5份，分別為鄭麥119、鄂麥25、鄂麥195、金優(yōu)18和鄭麥578，可優(yōu)先考慮小麥強筋育種的親本。

本研究中含有1B/1R異位系的材料占21.59%，與柳娜等［15］的結果47.1%相差較多，可能與親本的挑選有關。1B/1R異位系對面團流變學特性、面包和面條品質皆有極顯著的負面影響，選擇親本時應謹慎，尤其在選育優(yōu)質強筋小麥品種時。

低PPO活性可降低面粉加工和貯藏過程中的褐變程度，具有低PPO活性的小麥品種更適合加工傳統(tǒng)面食。本研究中基因型Ppo-A1b/Ppo-D1a（雙低PPO）的材料頻率為32.95%，與肖永貴等［16］的研究結果32.5%比較一致。

理想的優(yōu)質小麥品種（系）應是聚合多個優(yōu)異基因，如同時含有7+8亞基、5+10亞基、非1B/1R易位以及雙位點低PPO活性（Ppo-A1b/Ppo-D1a）。本研究中符合上述條件的材料有3份，分別為鄭麥119、鄭麥578和藁優(yōu)5766，可作為培育優(yōu)質小麥的親本材料。