高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定大白菜中維生素K1含量

于翰宗，田 蒙，姜 山，程 斐，孫朝暉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東 青島 266200）

維生素K是具有凝血作用的2-甲基-1，4-萘醌及其衍生物的一類(lèi)物質(zhì)，包含有維生素K1、維生素K2、維生素K3、維生素K44種形式［1］。維生素K1是人體必需的健康營(yíng)養(yǎng)素之一，對(duì)人體正常的生理機(jī)能運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要影響，主要的生理功能是凝血，同時(shí)是人體內(nèi)肝臟合成凝血酶原（凝血因子Ⅱ）、斯圖爾特因子（凝血因子X(jué)）、轉(zhuǎn)變加速因子前體（凝血因子Ⅶ）、血漿促凝血酶原激酶（凝血因子IX）所必需物質(zhì)，激活凝血因子是機(jī)體凝血功能正常發(fā)揮的必要條件［2］。缺乏維生素K1能引發(fā)凝血因子異常或合成障礙，導(dǎo)致出血現(xiàn)象并延長(zhǎng)凝血酶原，影響人體健康。近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道維生素K1還有預(yù)防癌癥、預(yù)防血管鈣化、參與骨代謝、抑制糖尿病性白內(nèi)障、治療毛細(xì)管支氣管炎、解毒等［3-7］生理功能。維生素K1存在廣泛，大部分來(lái)源于蔬菜，其中普通大白菜、西蘭花、甘藍(lán)等十字花科蔬菜含量均較高。

大白菜（Brassica rapaL.ssp.pekinensis）種植面積大，其產(chǎn)量在北方蔬菜中占較大比重。大白菜作為保健蔬菜，含有豐富的維生素和礦質(zhì)元素。但對(duì)白菜中維生素K1含量的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。相關(guān)研究中，高效液相色譜法、熒光法、色譜質(zhì)譜串聯(lián)法是維生素K1的主流檢測(cè)方法［8-11］。通過(guò)高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)活性成分進(jìn)行定性定量的分析是目前相對(duì)效率高、反應(yīng)靈敏、精準(zhǔn)可靠的檢測(cè)方式。維生素K1的傳統(tǒng)前處理方法主要有酶解法、液液萃取法、皂化法等［12-15］。目前，固相萃取技術(shù)在試樣分離、純化、濃縮過(guò)程中回收率較高，操作流程更加簡(jiǎn)化，成為樣品前處理的主流技術(shù)。本研究參考GB 5009.158—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素K1的測(cè)定》［16］，探究利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)不同球葉顏色的大白菜維生素K1含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料13份白菜樣品采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽(yáng)校區(qū)試驗(yàn)基地。

1.1.2 試劑 異丙醇、甲醇均為色譜純，Thermofisher公司；正己烷為分析純，杭州石化有限公司；二氯甲烷為色譜純，天津市康科德科技有限公司；乙酸乙酯為色譜純，Aladdin生化科技股份有限公司；氯化鋅、無(wú)水乙酸鈉為分析純，廣州化學(xué)試劑公司；99%維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。

1.1.3 儀器LC-20A型高效液相色譜儀、Shinpack GIST C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、AUW-220型電子分析天平，SHIMADZU；XHC旋渦混合器，常州儀器制造有限公司；DTC-27J型超聲波水浴鍋，中國(guó)湖北鼎泰生化技術(shù)設(shè)備制造有限公司；鋅粉還原柱（4.6 mm×50 mm，50～70 μm），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；HITACHI CT6E型離心機(jī)，日本日立有限公司；N-EVAP 11203030138型氮?dú)獯蹈蓛x，美國(guó)Organomation公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取純度99%標(biāo)準(zhǔn)品維生素K1油狀液體20 mg于棕色容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇分別溶解，定容至10 mL，混合均勻配制成2.0 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用標(biāo)準(zhǔn)移液槍準(zhǔn)確移取母液于棕色容量瓶中，加入色譜級(jí)甲醇進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥刹煌瑵舛龋?.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mg/mL）的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，上機(jī)測(cè)定，記錄峰面積。

1.2.2 樣品制備、提取與測(cè)定 稱(chēng)取已打成勻漿的新鮮樣品10 g（維生素K1含量不低于2 μg），加到具塞離心管中，加入40 mL異丙醇，蓋上塞子，渦旋混勻后超聲5 min，靜置1 min。加入10 mL正己烷，渦旋振蕩8 min，然后4 500 r/min離心5 min，用移液槍小心轉(zhuǎn)移上清液至50 mL具塞離心管中。再次加入10 mL正己烷提取操作1次，然后加入正己烷定容至25 mL棕色容量瓶。用氮?dú)獯蹈桑和槎ㄈ葜?.0 mL，待凈化。

中性氧化鋁柱經(jīng)5 mL正己烷活化后，將上述2.0 mL正己烷定容液以1.0 mL/min流速過(guò)柱，用5 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗柱子，后用7 mL正己烷溶液再次洗脫至10 mL試管中，氮?dú)獯蹈珊笥?.0 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)態(tài)濾膜過(guò)濾至1.5 mL液相進(jìn)樣小瓶中，待HPLC分析。

本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)積累經(jīng)驗(yàn)，改進(jìn)自國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的流動(dòng)相：使用甲醇900 mL、二氯甲烷100 mL、冰醋酸0.3 mL，混勻后，加入氯化鋅1.5 g、無(wú)水乙酸鈉0.5 g，經(jīng)過(guò)超聲溶解后，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾。

1.2.3 精密度試驗(yàn) 按照樣品溶液制備方法處理樣品，制作5份用于檢測(cè)樣品含量的平行樣品溶液，計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 根據(jù)樣品的實(shí)際測(cè)定數(shù)值，做加標(biāo)試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度圖表。準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)先混勻的維生素K1溶液1.0 mg（精確到0.1 μg），按含量0.5、1.0、1.5倍向供試品中加入維生素K1標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.00 μg/mL），按供試品溶液制備方法處理加標(biāo)樣品，對(duì)每個(gè)測(cè)試品平行操作3份。

1.2.5 人為目測(cè) 將白菜從中間豎切，由視覺(jué)正常的4人分別獨(dú)立觀察白菜球葉顏色，將葉色按白色到黃色深淺分為5級(jí)。即：1，純白；3，白色；5，淺黃；7，黃色；9，深黃。綜合4人統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行平行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖結(jié)果分析

利用高效液相色譜法檢測(cè)白菜維生素K1含量出峰時(shí)間較快，為6.7 min，樣品出峰時(shí)并不受其他雜質(zhì)峰的影響，可準(zhǔn)確分離和定量（圖1）。

圖1 維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品（a）和白菜樣品（b）色譜

2.2 可靠性

本研究層析柱的柱效比值為0.98；回收率為97.02%～109.1%；最小檢出限為4 μg/100 g。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.118%、0.736%。可證明高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定大白菜中維生素K1含量的結(jié)果準(zhǔn)確。

維生素K1線性方程為Y=10.233x-1.813 3，R2=0.996 9，在濃度為0.229～6.197 μg/mL時(shí)，利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定維生素K1含量的線性關(guān)系明顯。

2.3 穩(wěn)定性

測(cè)定供試品溶液峰面積及保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。維生素K1面積的RSD為1.228%，保留時(shí)間的RSD為2.350%，由此可見(jiàn)，在24 h內(nèi)供試品溶液含量穩(wěn)定。

表1 峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 檢出限

檢出限及定量限分別以3倍和10倍信噪比（S/N）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，當(dāng)取樣量為1.5 g，總定容體積為500 mL時(shí)，維生素K1含量的檢出限為0.29 μg/100 g，定量限為0.95 μg/100 g。

2.5 加標(biāo)回收率

測(cè)定樣品中維生素K1含量并計(jì)算其回收率。在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率分別為97.5%、98.2%、101.8%，說(shuō)明該方法測(cè)定K1含量可靠有效。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

取大白菜不同部位樣品的均勻制樣，共計(jì)13個(gè)品種，均來(lái)自萊陽(yáng)試驗(yàn)基地，按照高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定白菜中維生素K1含量，同時(shí)選取莖葉類(lèi)、鮮葉類(lèi)、菜花類(lèi)、蔥蒜類(lèi)、半野生類(lèi)、根莖類(lèi)（非淀粉）、茄果類(lèi)、鮮豆類(lèi)等日常生活中常見(jiàn)蔬菜進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行含量比較。結(jié)果顯示，不同類(lèi)型蔬菜維生素K1含量差別很大，對(duì)比表2和表3數(shù)值發(fā)現(xiàn)，大白菜維生素K1含量處于較高水平。由表3可以看出，大白菜不同部位的維生素K1含量差別較大，其中外葉白幫含量最低。球葉顏色越黃，維生素K1含量越高；在外葉綠葉部分，外葉顏色越綠，維生素K1含量越高。

表2 不同類(lèi)型蔬菜維生素K1含量

表3 不同品種大白菜中維生素K1含量

3 小結(jié)與討論

本研究建立了大白菜中維生素K1的分析檢測(cè)方法。采用異丙醇和正己烷試劑，對(duì)大白菜樣品去除葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素等雜質(zhì)干擾，能有效分離維生素K1，該方法出峰時(shí)間早、能有效分離雜峰、檢出限高，是對(duì)大白菜中維生素K1進(jìn)行檢測(cè)的優(yōu)選方法。由于順式維生素K1幾乎沒(méi)有活性且蔬菜中維生素K1絕大部分為反式維生素K1，因此，本試驗(yàn)定量分析維生素K1，即可代表大白菜中對(duì)人體有效維生素K1含量。

人為目測(cè)是直接根據(jù)大白菜球葉顏色差異對(duì)人視覺(jué)的刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)判、分級(jí)的方法，通過(guò)多人評(píng)定排除環(huán)境飾變，從而減少受環(huán)境的不穩(wěn)定影響。人為目測(cè)雖然沒(méi)有儀器檢測(cè)精確，但也有較高準(zhǔn)確性，并且易于操作，同時(shí)是當(dāng)下大白菜育種中田間檢測(cè)葉色相關(guān)性狀初步選擇的最常用方法。

對(duì)日常生活中常見(jiàn)蔬菜維生素K1含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型蔬菜維生素K1含量差別較大，縱向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，蔬菜顏色越綠，維生素K1含量越高，同時(shí)大白菜維生素K1含量處于較高水平，尤其是外葉綠色部分含量最高，由此建議人們?cè)谌粘Ｉ钪卸嗍惩馊~綠色部分。

大白菜是人們普遍食用的蔬菜，中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)建議中國(guó)居民維生素K1的適宜攝入量為120 μg/d［17］。本試驗(yàn)中，桔紅65、27-1、ZC22-1、419-2、健美、喜諾6個(gè)黃心品種維生素K1含量均超過(guò)120 μg/100 g。大白菜中維生素K1含量豐富，尤其是綠色部分，同時(shí)結(jié)合徐超等［18］研究可以推斷顏色越綠的蔬菜，維生素K1含量越高。在球葉為黃心的大白菜品種中，維生素K1的含量隨著黃色程度加深而提高。這也為育種工作者選育黃色球葉大白菜提供了重要的品質(zhì)性狀參考。