不同凈化方法對甘草有機氯農(nóng)藥殘留測定的比較研究

廖予菲，王 萍，張瑞瑞，程茜菲

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，西安 712046）

甘草（Glycyrrhiza uralensis）被譽為“中藥之王”，其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的上品藥材，其栽培過程中易受病蟲害影響，為保證品質(zhì)和產(chǎn)量常使用各種農(nóng)藥，易造成多種農(nóng)藥殘留。甘草一般3年采收，藥用部位為其根類，易受到環(huán)境中殘留的有機氯類農(nóng)藥影響［2］。因此，為保障用藥安全，中國藥典中對甘草藥材的有機氯農(nóng)藥殘留量有著嚴(yán)格的限制。

現(xiàn)行中國藥典有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法為GC法，與之相匹配的凈化方法包括磺化法（9種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法）、柱層析法（22種有機氯類農(nóng)藥殘留量測定法）［3］。磺化法是通過濃硫酸與提取液中脂肪、蠟質(zhì)等雜質(zhì)發(fā)生磺化反應(yīng)，將目標(biāo)化合物與雜質(zhì)分離，對酸穩(wěn)定且不易氧化的有機氯類農(nóng)藥較為適用［4］，但磺化法的操作步驟較多，所耗費時間久，無法實現(xiàn)有機氯類農(nóng)藥的快速測定。QuEChERS是一種快速高效的樣品前處理方法，近年來，在農(nóng)藥殘留量檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，中國藥典2020版中將該方法作為禁用農(nóng)藥殘留測定的前處理方法之一［5，6］。

本研究對比了磺化法及QuEChERS法2種樣品凈化方法，以期為快速高效測定中藥中的有機氯類農(nóng)藥殘留提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器Agilent 7820型氣相色譜儀（配電子捕檢測器），美國安捷倫科技有限公司；TE124S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ5200DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；MTV1-100型多管渦旋混合儀，杭州奧盛儀器有限公司。

1.1.2 試驗試劑9種有機氯農(nóng)藥混合對照品100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號105198。QuEChERS萃取鹽包、QuEChERS dSPE樣品萃取凈化管，日本島津制作所；乙腈（色譜純），美國Fiher公司；丙酮（農(nóng)殘級），德國Merck公司；石油醚（60～90℃）（農(nóng)殘級）、氯化鈉（優(yōu)級純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷（農(nóng)殘級），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸、無水硫酸鈉為分析純。甘草（批號：1903021119A、2005021119A，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，河北盛泰藥業(yè)有限公司），由陜西國際商貿(mào)學(xué)院王萍副教授鑒定為脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）的干燥根，經(jīng)前期檢測，2005021119A未檢出農(nóng)藥殘留，可作為陰性空白，1903021119A檢出六六六、滴滴涕。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱選擇Agilent DB-1701型彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣方式為不分流進樣；進樣溫度為230℃；檢測器溫度為300℃；進樣體積為1 μL；柱流量為60 mL/min。

升溫程序：從100℃開始，不保持，以10℃/min升溫至220℃，再以8℃/min升溫至250℃，持續(xù)10 min。

1.2.2 對照品溶液配制 精密量取9種有機氯混合對照品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶，取石油醚（60～90℃）稀釋定容至刻度，作為對照品儲備溶液。

精密量取上述混合對照品儲備溶液5、25、50、250、500、1 250 μL分別置于10 mL容量瓶，加石油醚（60～90℃）稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

1）磺化法。甘草樣品粉碎混勻，過三號篩，精密量取2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加去離子水20 mL浸泡過夜，精密量取丙酮40 mL，稱定并記錄重量，超聲30 min，放冷至室溫，再次稱定重量，滴加丙酮補足減失的重量，加入氯化鈉約6 g，精密加入二氯甲烷30 mL，稱定重量，超聲處理15 min，再稱定重量，滴加二氯甲烷補足減失的重量，靜置使分層，將上層溶液迅速轉(zhuǎn)移至裝有適量無水硫酸鈉的100 mL具塞錐形瓶中，靜置4 h。精密分取35 mL，于40℃水浴減壓濃縮至近干，加少量石油醚（60～90℃），反復(fù)操作至丙酮及二氯甲烷除盡，用石油醚（60～90℃）溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度離心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀釋至5 mL，小心加入硫酸1 mL，渦旋1 min，3 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液2 mL，置于刻度離心管中，40℃下氮吹濃縮至適量，精密稀釋至1 mL，過0.22 μm濾膜即得。

2）QuEChERS法。甘草樣品粉碎混勻，過三號篩，精密量取2 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置 振 蕩 器 上 劇 烈 振 蕩（500次/min）5 min，加 入QuEChERS萃取鹽包，立即搖散，再置于振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心（4 000 r/min）5 min，取上清液9 mL，置于QuECh-ERS dSPE樣品萃取凈化管中，渦旋使充分混勻，置于振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全，離心（4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上于40℃水浴濃縮至近干，加石油醚（60～90℃）稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜即得。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.2”中標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液各濃度1 μL分別注入氣相色譜儀，每個濃度重復(fù)測定2次，以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 測定法 按“1.2.1”中色譜條件操作，精密吸取“1.2.3”中2種方法處理的供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，分別連續(xù)進樣2次，取2次平均值，按外標(biāo)法計算供試品中農(nóng)藥殘留量。

1.2.6 重復(fù)性對比研究 取批號為1903021119A的供試品粉末，分別按照“1.2.3”中2種方法各制備6份樣品，每份重復(fù)測定2次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算出供試品中農(nóng)藥殘留量。

1.2.7 檢測限對比研究 取批號為2005021119A的供試品粉末，通過比較低濃度分析物樣品與空白樣品測量的信號，依據(jù)信噪比為3∶1對應(yīng)的最低濃度為檢出限的規(guī)定，倍比稀釋相應(yīng)濃度的對照品溶液加入供試品，分別按照“1.2.3”中2種前處理方法各制備3份樣品，每份重復(fù)測定2次。

1.2.8 加標(biāo)回收率對比研究 取批號為1903021119A的供試品粉末，精密稱定9份，分別精密加入50 ng/mL的混合對照品溶液3、6、9 mL各3份，按“1.2.3”中的磺化法制備，每份重復(fù)測定2次。同法測定QuECh-ERS法制備樣品的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖及線性關(guān)系考察

2種凈化方法所制樣品中雜質(zhì)對9種有機氯測定均無干擾，由圖1可以看出，QuEChERS處理效果更佳，雜質(zhì)較少。線性考察結(jié)果見表1，結(jié)果表明，六六六、滴滴涕、五氯硝基苯在濃度為1.00～250.00 ng/mL時與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

圖1 甘草有機氯農(nóng)藥殘留量檢測氣相色譜

2.2 重復(fù)性、檢測限對比研究結(jié)果

批號為1903021119A的供試品中δ-BHC、OP＇-DDT有檢出，如表2所示，磺化法所制樣品2種農(nóng)藥殘留量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.01%、3.23%；QuEChERS法所制樣品2種農(nóng)藥殘留量的RSD分別為1.76%、1.55%。2種前處理方法的檢出限測定結(jié)果見表3，相較而言，QuEChERS法比磺化法更具優(yōu)勢。

表2 兩種前處理方法重復(fù)性試驗結(jié)果 （單位：mg/kg）

表3 兩種前處理方法檢出限試驗結(jié)果 （單位：mg/kg）

2.3 加標(biāo)回收率對比研究結(jié)果

磺化法加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表4，QuEChERS加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表5。采用SPSS 25.0軟件對回收率對比試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)均采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果（表6）顯示，2種方法對大部分有機氯農(nóng)藥回收率結(jié)果無顯著性差異，而對α-BHC、β-BHC 2種農(nóng)藥殘留回收率結(jié)果表明，QuEChERS法回收率顯著高于磺化法，該方法操作簡單，步驟少，能相應(yīng)減少樣品處理過程中分析對象的損失。

表4 磺化法加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表5 QuEChERS法加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表6 兩種前處理方法回收率測定結(jié)果比較

3 小結(jié)與討論

3.1 甘草農(nóng)藥殘留量測定前處理

對甘草樣品進行前處理時，因樣品纖維較多，難以完全粉碎后通過3號篩，容易造成平行樣品之間RSD偏大的現(xiàn)象，應(yīng)盡量做到粉碎完全，混合均勻取樣，也可通過增加平行樣個數(shù)來解決這一問題。此外，在通過磺化法處理甘草樣品時，因其含多糖類成分，試驗操作至“40℃水浴減壓濃縮至近干”時，易出現(xiàn)黏稠掛壁物質(zhì)，為了避免農(nóng)藥殘留損失，不宜濃縮至太干，轉(zhuǎn)移至離心管的操作應(yīng)取適量石油醚（60～90℃）進行充分洗滌。

3.2 甘草樣品有機氯農(nóng)藥殘留情況

有機氯農(nóng)藥脂溶性強，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，殘留時間久，易在生物體中富集，造成肝、腎、神經(jīng)等損傷，是藥品標(biāo)準(zhǔn)中重點控制的重要污染物。甘草作為根莖類藥材極易富集農(nóng)藥殘留，《中國藥典》2020版一部要求甘草“含五氯硝基苯不得超過0.1 mg/kg”。本試驗采購了15批次甘草進行農(nóng)藥殘留量測定，從結(jié)果來看，大多數(shù)批次飲片有痕量六六六、滴滴涕或五氯硝基苯等農(nóng)藥檢出，但總體符合藥典要求，滿足藥用原料要求。

本試驗以甘草作為研究對象，采用氣相色譜法，分別通過磺化法及QuEChERS法進行樣品凈化處理，通過考察方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、檢測限，對2種前處理方法進行評價。結(jié)果表明，2種方法均能專屬、快速、靈敏、準(zhǔn)確地實現(xiàn)樣品處理分析，均可作為甘草有機氯農(nóng)藥殘留量測定的前處理方法，但綜合經(jīng)濟成分和時間成本分析，QuEChERS法操作簡單，步驟少，較適合作為甘草樣品農(nóng)藥殘留量測定的凈化方法。QuEChERS法沒有磺化法適用范圍窄的缺點，可推廣到其他類型農(nóng)藥殘留檢測中。但中藥往往基質(zhì)復(fù)雜，該方法對于其他藥材或中成藥農(nóng)藥殘留測定是否適用，仍需進一步試驗驗證。

續(xù)表4

續(xù)表5

續(xù)表5