一例隆林山羊敗血癥的診斷與治療

李佳榮，李鵬舉，陳海蘭，韋英明，潘 艷

（1.廣西百色農業學校，廣西 百色 533000；2.廣西大學，a.動物科學技術學院；b.農牧產業發展研究院，南寧 530004；3.廣西農業職業技術大學，南寧 530007）

細菌混合感染引起的出血性腸炎、纖維素性肺炎是養殖山羊中經常發生的疾病。細菌混合感染的復雜性使疾病的診斷與預防頗為棘手。通過實驗室鑒定結合臨床癥狀綜合分析，才能確定主要導致血性腸炎、纖維素性肺炎的病菌，然后通過藥物篩選進行合理治療。大多數山羊細菌混合感染與養殖條件及疾病預防有緊密聯系，因此，改善養殖環境、滿足羊群營養需求、加強免疫力才是預防和控制疾病的有力措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 廣西某隆林山羊養殖場突然病死的山羊，剖解后取出心、肝、脾、肺、腎、十二指腸送至實驗室檢測。

1.1.2 試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMaster Mix（Dye）、ddH2O均購自北京康為世紀生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒、伊紅美藍瓊脂培養基、LB營養肉湯固體培養基、LB營養肉湯液體培養基、哥倫比亞血平板等均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 引物設計與合成PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于檢測綿羊肺炎支原體（MO2）、絲狀支原體山羊亞種（MMMLC2）、多殺性巴氏桿菌A型（PMA）與多殺巴氏桿菌D型（PMD）、溶血曼氏桿菌（MH）、隱秘桿菌（AP）、16S rDNA通用引物。引物如表1所示。

表1 PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 用點燃的酒精棉球在各內臟取樣點表層消毒滅菌，選取病變較為明顯的部位剪開，用無菌接種環蘸取病變組織部位劃線于伊紅美藍瓊脂培養基、哥倫比亞血平板和LB營養肉湯固體培養基上，培養24 h［1］。

1.2.2 細菌的分離 用平板劃線法挑取單個菌落，反復挑取6～8次［2］，革蘭氏染色鏡檢，挑取較為純凈單一的菌種進行分子鑒定。

1.2.3 病料DNA/RNA的提取 將肺臟的病變部位剪取小部分，置于無菌研缽中，加入1 mL雙蒸水進行研磨，直至組織樣品破碎，然后將研磨好的組織樣品裝入2 mL EP管中，反復凍融3次，使病菌細胞破裂，通過DNA/RNA提取試劑盒提取細菌DNA/RNA［3］，置于-20℃備用。

1.2.4 單一細菌DNA/RNA的提取 于1.5 mL離心管中加入0.3 mL雙蒸水，挑取已經分離純化的單個菌落于離心管中，按照細菌基因組提取試劑盒中操作步驟提取。

1.2.5 PCR鑒定 參考國家標準GB/T19915.4—2000，對樣品進行PCR鑒定。PCR反應體系：2×EsTaqMaster Mix（Dye）25 μL，上、下游引物各2 μL，樣品6 μL，補ddH2O至50 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參考各引物的退火溫度，見表1），72℃延伸1 min，30個循環；72 min延伸4 min；4℃保存［4］。取10 μL PCR產物加入到1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，通過凝膠成像系統觀察分析。

1.2.6 病菌的K-B藥敏試驗 利用無菌接種環挑取單個菌落于滅菌的生理鹽水中，制備成0.5麥氏單位的菌懸液，然后用無菌的棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于血平板上，將藥敏紙片貼在平板內，37℃培養24 h，觀察并測量抑菌環的直徑并記錄［5］。

1.2.7 16S rDNA測序結果分析 由于采用二代測序技術，每次只能獲取800 bp堿基序列，因此，測序時將16S區進行分開讀取，即前端加標記物、引物和v1～v4區的片段，而后段采用逆向測序。在比對分析時要取出前后兩端的標記物和引物，連接16S區，然后在數據庫中進行比對。

1）16S區的拼接。在DNAman軟件中Sequence選項下選擇Sequence Assembly，然后Add file添加seq文件的27F前端與1492R后段，之后點擊Assemble，若顯示有重疊區，則表示可以進行拼接，再選擇show result，最后Export在txt文本中備用［6］。而大多數16S區經過拼接基本上穩定在1 410～14 850 bp。結果中出現雙峰，則表示分離到的細菌不是單一菌種，需要進一步進行純化分離，然后繼續進行測序。

2）拼接序列的比對。打開NCBI數據庫中BLAST下的nucleotide blast進行選擇，然后復制拼接好的文本文件中的堿基序列于數據庫中，同時以Standard databases數 據 庫 和rRNA/ITS databases兩個數據庫中的比對結果共同參考，若兩個數據庫中相同菌種的相似度均>99%，則認為測序菌種和比對的菌種為同一菌種；若相似度在98%～99%，則認為測序菌種有50%的概率和比對的菌種為同一菌種；若相似度在97%～98%，則認為測序菌種有20%的概率和比對的菌種為同一菌種；若相似度在95%～97%，則認為測序菌種為新的種；若相似度<95%，則認為測序菌種為新的屬，可進一步進行新的細菌鑒定［7］。

2 結果與分析

2.1 臨床病理變化

對內臟解剖觀察發現肺臟出血、尖葉黏連；肝臟出血，有壞死灶；腸道出血，有惡臭味；腎臟有出血斑點；脾臟腫大呈現血黑色。

2.2 細菌的分離

在伊紅美藍瓊脂培養基上觀察到深紫黑色、光滑、帶有金屬光澤的圓形菌落。革蘭氏染色鏡檢，呈兩端頓圓、粉紅色桿狀的形態，結合臨床癥狀判斷為致病性大腸桿菌［8］。而在血平板培養基和LB營養肉湯培養基上分離到5株純化的細菌，經過16S rDNA鑒定分別為大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、印度不動桿菌、豚鼠氣單胞菌、科氏葡萄球菌。其中大腸桿菌與伊紅美藍平板中的鑒定結果一致，而多殺巴氏桿菌與PCR鑒定結果一致，這些細菌均會導致內臟出血而引起動物發病，與臨床癥狀相吻合。

2.3 革蘭氏染色結果

對分離純化的細菌進行革蘭氏染色，判定其基本的外形特征，革蘭氏染色結果如圖1所示。

圖1 5種細菌的革蘭氏染色結果

2.4 PCR鑒定結果

對研磨樣品進行PCR鑒定，被檢測樣品中只有多殺巴氏桿菌D型出現了657 bp的條帶，其他樣品均無條帶，該羊感染的是多殺性巴氏桿菌D型（表2）。

表2 樣品PCR鑒定結果

2.5 系統發育樹

將16S堿基序列經過DNAman軟件拼接，再在NCBI數據庫中比對，選擇相似度大于97%的菌株16S序列；最后使用MEGA-X軟件繪制系統發育樹，經過Neighbor-Joining算法對堿基序列進行逐一比對，繪制系統發育樹。當待鑒定菌種與相似菌種在同一個枝干上時，則表示待鑒定菌種為該菌種，從而確定待鑒定菌種［9］。系統發育樹結果如圖2所示。

圖2 5種細菌的16S系統發育樹

2.6 藥敏試驗結果

選擇22種藥敏試紙片進行藥敏試驗，結果如表3所示。混合細菌對羅紅霉素、利福平、青霉素、四環素、林可霉素、諾氟沙星、強力霉素、環丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、復方新諾明、阿奇霉素不敏感；對頭孢曲松、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢他啶、多粘菌素中度敏感；而對頭孢噻肟、替米考星、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感。

表3 藥敏試驗結果

2.7 防治措施

隔離患病羊只是關鍵，防止疾病的蔓延，便于精準化用藥治療。具體治療措施如下：①替米考星注射液0.04 mL/kg，皮下或肌肉注射，每天1次，連用5 d；②青霉素鈉與恩若沙星注射液液混合0.1 mL/kg，肌肉注射，每天2次，連用5 d。2種治療方案交替使用可以防止混合菌產生抗藥性，更有利于殺滅細菌［10］。

3 討論

3.1 5株分離菌株的鑒定

大腸桿菌廣泛存在消化道內，只有少數為致病性大腸桿菌，因此分子鑒定可以鑒定到亞種水平，再通過臨床特征上山羊腹瀉癥狀，因此確定為致病性大腸桿菌；而通過多殺性巴氏桿菌的特定性引物、16S測序以及多器官有出血及出血點等綜合判斷為多殺性巴氏桿菌［11］；印度不動桿菌在血平板上生長時為乳白色，表面光滑不透明，且容易產生難聞氣味，該菌株廣泛存在于垃圾堆，而臨床剖解中也發現內臟中產生腐敗的氣味，因此綜合判斷為印度不動桿菌［12］；豚鼠氣單胞菌可引起動物腹瀉，因此分離出菌株與臨床癥狀相符合［13］；而科氏葡萄球菌菌落不透明、乳白色、菌落表面光滑、兼性厭氧、革蘭氏陽性球菌，血平板培養有溶血環，易引起體溫升高、炎癥以及敗血癥等，且會導致動物的急性死亡。這也與臨床癥狀相符合，因此綜合判定為科氏葡萄球菌［14］。

3.2 飼料配方的調整與優化

通過對該養殖場飼料檢測，發現該養殖場中30 kg體重成年育肥公羊的營養不合理，從而導致羊群的營養不均一、未能達到該階段羊群的需要量，造成免疫力低下，養殖成本居高不下，因此需要重新制定全混合飼料。

4 小結

高溫高濕容易引起病菌的滋生與蔓延，同時空氣流動性較差，加速傳染性疾病的傳播，因此做好環境殺菌與羊群抽檢十分必要，可為精準化治療與防疫提供可靠的依據，避免盲目用藥，提高養殖效益。同時改善飼養環境，隨時根據羊群的生長階段改變飼料配方，使羊群營養處于達標水平，從源頭上控制預防疾病。