青霉屬真菌Penicillium sp.1502次級代謝產物鑒定及其生物活性研究

張亞妮，劉曼莉，張志剛，萬中義，吳兆圓，王開梅，方 偉

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

青霉屬（Penicillium）真菌是廣泛存在于自然環境中的一類腐生類真菌。其與大部分腐生類真菌一樣可以產生萜類、聚酮類、生物堿類、大環內酯類和醌類等次級代謝產物，這些次級代謝產物在抗菌、抗病毒、抗腫瘤或抗心血管疾病以及抗蟲等方面表現出不同的活性［1-3］。其中，一些代謝產物已經被開發成藥物，例如目前具有廣譜抗菌活性的青霉素，已經用于臨床醫學的洛伐他汀和抗真菌的灰黃霉素［4］。近年來，又發現不少青霉屬真菌來源的結構新穎且活性良好的代謝產物，如新骨架二倍半萜類化合物peniroquesine A至peniroquesine C，它們是從1株婁地青霉Penicillium roquefortiYJ-14中分離所得，peniroquesine B和peniroquesine C對多種腫瘤細胞均有一定的抑制活性，尤其是對人乳腺癌細胞（MCF-7）的體外細胞毒性較強，IC50分別為16.40、14.11 μmol/L，顯著高于 陽性對照cisplatin（IC50為33.55 μmol/L）［5］。新的聚酮類化合物isochaetochromin A1與已知化合物isochaetochromin B1及isochaetochromin B2源自同一株青霉屬真菌FKI-4942，均具有抑制甘油三酯合成的作用，其中isochaetochromin B1的抑制作用最強，IC50為5.6 μmol/L［6，7］。新的硫代二酮哌嗪生物堿penicibrocazine A至penicibrocazine E，這5個生物堿分離自紅樹植物白骨壤的內生真菌青霉菌Penicillium brocaeMA-231發酵液中。化合物penicibrocazine B至penicibrocazine D均對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較強的抑制活性，其最低抑菌濃度（MIC）分別為32.00、0.25、8.00 μg/mL；化合物penicibrocazine C對藤黃微球菌（Micrococcus luteus）表現出明顯高于陽性對照氯霉素（MIC2.0 μg/mL）的抑制活性，其MIC為0.25 μg/mL。此外，化合物penicibrocazine A至penicibrocazine C對植物病原真菌小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）表現出較強的抑制活性，其MIC分別為0.25、8.00、0.25 μg/mL［8］。不斷發現的次級代謝產物擴展了青霉屬真菌化合物結構及生物活性的多樣性，為新的藥物開發提供了研究基礎。

湖北省生物農藥工程研究中心擁有豐富的微生物資源，在從真菌來源中篩選具有生物活性的次級代謝產物過程中，發現1株具有抑菌活性的菌株，經ITS rRNA鑒定為青霉屬Penicilliumsp.KC345662，編號為NH-1502。對其發酵提取物進行HPLC-MS初步分析，發現其含有豐富多樣的次級代謝產物。為了明確這些次級代謝產物的化學結構，對菌株Penicilliumsp.1502進行了大量發酵、提取、分離純化，獲得了化合物1至化合物6，并在實驗室條件下對其進行了抑菌、抗植物病原真菌及殺蟲等活性評價，以期為青霉屬來源的次級代謝產物在農用方面的研究開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 真菌NH-1502，分離自武漢市周邊的土樣中，現保存于湖北省生物農藥工程研究中心。菌株經ITS分析比對，其序列與Penicilliumsp.KC345662高度相似（相似度為100%），鑒定為青霉屬真菌Penicilliumsp.1502，保存編號為NH-1502。

1.1.2 抗細菌生測指示菌 大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureusATCC 25923）購自中國典型培養物保藏中心，豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiaeWH13013）、豬鏈球菌（Streptococcus suisSC19）由華中農業大學譚臣教授課題組提供（在無菌條件下將菌液與30%濃度甘油1∶1等體積混合于離心管中，甘油終濃度為15%，-20℃超低溫冰箱中保存）。

1.1.3 抗真菌生測指示菌 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Hiveum）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）均分離于染病植物的果實或葉片（所測試病原真菌保存在-80℃超低溫冰箱25%甘油管中，使用前將甘油管活化于PDA平板備用）。

1.1.4 供試昆蟲 豆蚜（Aphis craccivora）由湖北省生物農藥工程研究中心通過野外蚜蟲馴化培養所得。

1.1.5 儀器和主要試劑Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標，δ為mg/L，J為Hz）（德國Bruker BioSpin公司）；BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋轉蒸發儀（瑞士步琦）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）、Waters高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動收集系統，Waters2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）、Waters Xevo TQD UPLC-MS超高效液質聯用（美國Waters）；提取分離用試劑甲醇、乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產；去離子水（德國默克）；春雷·王銅（春雷霉素含量2%，王銅含量45%），購自陜西麥可歲生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株發酵和提取 菌株NH-1502在種子培養基（PDA）中于28℃，以轉速120 r/min進行振搖培養。發酵96 h后，在無菌條件下將種子發酵液（10%）轉移至含有發酵培養基（PDA）的500 mL錐形瓶中（每瓶200 mL）發酵，在28℃的溫度下，置于搖床上以120 r/min的轉速培養120 h。初篩時發酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。向大量發酵的5 L發酵液中加入5 L乙酸乙酯，攪拌提取3次，合并提取液過濾后真空濃縮得到提取物1.2 g。

1.2.2 代謝產物的分離純化 大量發酵的乙酸乙酯提取物用少量甲醇溶解，經硅膠柱色譜進行柱層析，用石油醚/乙酸乙酯進行梯度洗脫，洗脫組分通過HPLC檢測合并為12段（Fr.1至Fr.12）。根據HPLC檢測分析結果，應用制備液相色譜對組分Fr.4至Fr.8進行進一步分離純化，色譜柱為Waters Sunfire prep C18OBD柱（19 mm×250 mm，5 μm），流速為24 mL/min，洗脫梯度33 min（梯度為20%～100%乙腈），由Fr.4分離到化合物1（5.65 mg）和化合物2（12.88 mg），由Fr.5獲得化合物3（10.54 mg），由Fr.6獲得化合物4（8.22 mg），由Fr.7獲得化合物5（20.67 mg），由Fr.8獲得化合物6（2.27 mg），其結構如圖1所示。

圖1 化合物結構

1.2.3 生物活性測定 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定采用美國臨床和實驗室標準協會（CLSI 2012）推薦的微量肉湯稀釋法進行。將純化的細菌劃線接種于LB或TSA固體培養基上，37℃培養24 h，挑取單菌落接種于LB或TSB液體培養基中，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養12 h。將菌液按1∶1 000的比例接種于LB或TSB液體培養基，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養至OD600nm約為0.5（菌量約為1×108CFU/mL），再將菌懸液1∶100稀釋后備用。在96孔培養板中每孔加入50 μL倍比稀釋不同濃度的藥物，加入50 μL稀釋的菌液，每種藥物每株菌3次重復，同時設陰性對照和陽性對照。對照藥物選擇青霉素、鏈霉素置于37℃溫箱中孵育16～20 h，讀取結果。肉眼觀察微量稀釋孔中以無細菌生長現象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對該種細菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3次，以3次結果的平均值作為此藥對該細菌的MIC。

抗真菌活性測試采用96孔盤法［9］，將化合物1至化合物6配制成100 μg/mL的溶液。同時提前準備好指示菌及瓊脂培養基的混合物（指示菌的濃度約為1×107CFU/mL），在無菌96孔板中，每孔加入待測樣品10 μL，加入培養基與指示菌的混合物90 μL，混合均勻，每樣品重復3孔，培養4 d后檢查結果。活性分級評價指標：采用目測分級法進行，按3、5、7、9分級記錄菌絲生長的密度。各級數具體指標以標準樣品藥效為基準確定。3表示對病原真菌菌絲無抑制作用，與加入溶劑空白對照組的病原真菌菌絲生長一致；5表示靶標菌絲部分生長；7表示靶標菌絲少量生長；9表示抑菌率為100%，指示病原真菌無菌絲生長。陽性對照為春雷·王銅稀釋500倍溶液。

化合物1至化合物6對蚜蟲的殺蟲活性采用浸葉法［10］。每種化合物用0.1%吐溫-80乙醇溶液制備成5種濃度梯度（1 000、500、250、125、62.5 μg/mL）。在實驗室條件下，將帶蚜蟲大豆幼苗浸入不同濃度的供試樣品溶液5 s，吸取多余的溶液，然后置于室溫培養。每種處理重復3次，72 h后，與陰性對照和85%阿維菌素陽性對照比較，觀察死亡率。然后計算致死濃度50%（LC50）。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1：淡黃色粉末，分子式為C18H18O8，相對分子質量為362.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.75（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），6.74（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.31（1H，br s，H-3），5.62（1H，br s，H-5），3.76（3H，s，H-8），3.69（3H，s，H-9＇），3.61（3H，s，H-8＇），2.06（3H，s，H-9＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：167.0（s，C-7），165.3（s，C-3＇），157.0（s，C-6），156.4（s，C-2），155.1（s，C-6＇），153.4（s，C-5＇），140.2（s，C-4），133.7（s，C-3＇），125.6（s，C-1＇），109.5（d，C-3），107.5（d，C-2＇），107.2（s，C-1），104.8（d，C-4＇），104.3（d，C-5），56.0（q，C-9＇），52.0（q，C-8＇），51.9（q，C-8），21.4（q，C-9）。以上核磁數據與文獻［11］報道的methyl asterric acid的核磁數據基本一致，確定該化合物為methyl asterric acid。

化合物2：淡黃色粉末，分子式為C18H16Cl2O8，相對分子質量為430.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.76（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.66（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），3.64（3H，s，H-8），3.60（3H，s，H-9＇），3.27（3H，s，H-8），2.45（3H，s，H-9）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：164.5（s，C-7＇），163.8（s，C-7），154.7（s，C-6＇），152.9（s，C-5＇），149.2（s，C-2），149.0（s，C-6），135.7（s，C-4），135.1（s，C-3＇），124.4（s，C-1＇），115.6（d，C-3），115.5（d，C-5），112.5（s，C-1），107.4（d，C-2＇），104.7（d，C-4＇），56.1（q，C-9＇），52.0（q，C-8），51.9（q，C-8＇），18.2（q，C-9）。以上核磁數據與文獻［11］報道的methyl 3，5-dichloroasterric acid的核磁數據基本一致，確定該化合物為methyl 3，5-dichloroasterric acid。

化合物3：淡黃色針狀結晶，分子式為C17H16O7，ESI-MS（m/z）陰離子：331.1［M-H］-，相對分子質量為332.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.43（2H，br s，2＇，6＇-OH），9.98（1H，br s，4-OH），6.90（1H，d，J=2.1 Hz，3-H），6.67（1H，d，J=2.2 Hz，5-H），6.08（2H，br s，3＇5＇-H），3.64（3H，s，7-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.15（3H，s，7’-CH3）；13C NMR（DMSOd6，125 MHz）δ：199.6（s，C-10），165.6（s，C-8），161.6（s，C-2＇），161.6（s，C-6＇），158.1（s，C-4），156.8（s，C-6），147.2（s，C-4＇），127.9（s，C-2），126.2（s，C-1），109.1（s，C-1＇），107.6（d，C-5＇），107.2（d，C-3＇），107.2（d，C-3），103.4（d，C-5），56.0（q，C-7），52.1（q，C-9），21.6（q，C-7＇）。以上核磁數據與文獻［11，12］報道的sulochrin的核磁數據基本一致，確定該化合物為sulochrin。

化合物4：淡黃色針狀結晶，分子式為C17H16ClO7，ESI-MS（m/z）：365.4/367.4［M-H］-，相對分子質量為366.4；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.37（1H，s，OH-6＇），10.45（1H，s，OH-2＇），10.07（1H，s，OH-4），6.91（1H，d，J=2.1 Hz，H-3＇），6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.20（1H，s，H-5＇），3.65（3H，s，H-7），3.65（3H，s，H-9），2.24（3H，s，H-7＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.0（s，C-10），165.6（s，C-8），158.5（s，C-2＇），158.4（s，C-6＇），158.2（s，C-4），156.8（s，C-6），144.6（s，C-4＇），128.0（s，C-2），125.5（s，C-1），110.4（s，C-3＇），110.0（s，C-1＇），108.5（d，C-5＇），107.3（d，C-3＇），103.5（d，C-5），56.0（q，C-7），52.2（q，C-9），20.6（q，C-7＇）。以上核磁數據與文獻［13］報道的monochlorsulochrin的核磁數據基本一致，確定該化合物為monochlorsulochrin。

化合物5：黃色固體，分子式為C17H14Cl2O6，ESIMS（m/z）：399.0（［M-H］-），分子量為400.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.75（1H，br s，OH-2），11.75（1H，br s，OH-6），10.14（1H，s，OH-11），6.93（1H，d，J=2.1 Hz，H-10），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-12），3.67（3H，s，H-17），3.66（3H，s，H-16），2.24（3H，s，H-14）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.3（s，C-7），165.7（s，C-15），158.7（s，C-11），156.8（s，C-13），155.2（s，C-6），141.8（s，C-4），128.0（s，C-9），125.4（s，C-8），112.3（s，C-3），112.3（s，C-5），107.5（d，C-10），103.6（d，C-12），56.1（q，C-17），52.3（q，C-16），18.9（q，C-14）。以上核磁數據與文獻［14］報道的dihydrogendin的核磁數據基本一致，確定該化合物為dihydrogendin。

化合物6：橙紅色無定型固體，分子式為C18H16O6，ESI-MS（m/z）：329.1［M+H］+，相對分子質量 為328.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.23（1H，s，OH-1），7.49（1H，d，J=1.1 Hz，H-4），7.22（1H，d，J=1.7 Hz，H-5），7.15（1H，d，J=1.1 Hz，H-2），6.86（1H，d，J=1.7 Hz，H-7），4.69（1H，d，J=3.6 Hz，OH-2＇），3.91（3H，s，8-OCH3），2.74（1H，dd，J=9.5，3.6 Hz，H-1＇），2.69（1H，dd，J=9.5，5.3 Hz，H-1＇），1.09（3H，d，J=4.4 H-3＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：186.4（s，C-9），182.5（s，C-10），164.5（s，C-6），163.5（s，C-8），161.5（s，C-1），148.6（s，C-6），136.9（s，C-10a），131.8（s，C-4a），124.9（d，C-2），119.7（d，C-4），114.7（s，C-9a），112.7（s，C-8a），107.0（d，C-5），105.0（d，C-7），66.6（q，C-2＇），56.4（q，8-OCH3），45.0（t，C-16），23.5（q，C-3＇）。以上核磁數據與文獻［15］報道的penipurdin A的核磁數據基本一致，確定該化合物為penipurdin A。

2.2 抗菌活性

采用微量肉湯稀釋法測試化合物1至化合物6對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、豬丹毒的活性。結果（表1）表明，化合物1和化合物6對這4種細菌無抑制活性；化合物2僅對金黃色葡萄球菌有微弱的抑制活性，其MIC為200 μg/mL；化合物3、化合物4對豬鏈球菌的MIC均為200 μg/mL；化合物5對金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌均具有微弱的抑制活性，MIC均為200 μg/mL。

表1 化合物的抑菌活性結果 （單位：μg/mL）

2.3 抗真菌及殺蟲活性

96孔盤法抗真菌活性試驗結果表明，化合物1至化合物6在濃度為100 μg/mL時，對所測試的6種植物病原真菌并無明顯抑制活性。浸葉法殺蚜蟲活性測試結果表明，化合物1至化合物6在96 h內均無殺蚜蟲活性。

3 討論

本研究從青霉菌屬真菌Penicilliumsp.1502的發酵提取物中分離到methyl asterric acid（1）、methyl 3，5-dichloroasterric acid（2）、sulochrin（3）、monochlorsulochrin（4）、dihydrogendin（5）和penipurdin A（6）共6個化合物。化合物1、化合物2是擁有二苯醚結構asterric acid的衍生物，Lee等［11］研究表明在濃度為3～10 μg/mL時，這些化合物均能顯著抑制血管內皮生長因子（VEGF）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的毛細血管形成，asterric acid衍生物可作為抗血管生成藥物用于進一步研究。化合物3、化合物4、化合物5是二苯酮類化合物，來源于曲霉屬或者青霉屬的發酵液中，表現出廣泛的生物活性，如微弱的抗真菌、抗細菌和細胞毒活性［12，16］。此外，Ohashi等［17］研究發現化合物3和化合物4對嗜酸性粒細胞脫顆粒具有較強的抑制活性，其IC50分別為0.1、0.3 μmol/L；尤其是化合物3有望成為抗過敏藥物的良好先導化合物。化合物5在cyclophilin A異構酶上的對接和分子動力學模擬試驗顯示了其作為抗病毒和免疫抑制劑的重要潛在活性［14］。化合物6屬于蒽醌類化合物，與penipurdin B同時分離自土壤源的紫青霉菌Penicillium purpurogenumSC0070、penipurdin B對A549、HepG2和Hela 3種癌細胞系展現出一定的活性，然而化合物6（penipurdin A）對這3種細胞系并無細胞毒活性［15］。

在篩選菌時，菌株NH-1502顯示了較好的抗菌活性，但是活性測試結果表明僅化合物3、化合物4和化合物5對豬鏈球菌有微弱的抑菌活性；這有可能是活性化合物未被分離得到，亦可能存在協同增效作用。分析結構特征可以發現，化合物1至化合物5都擁有二苯基，化合物1和化合物2是二苯基直接連在一個氧原子上，屬于二苯醚類；化合物3、化合物4、化合物5是二苯基連接在1個酮羰基上，這些結構上的差異可能導致了化合物的活性差異。化合物1至化合物6對被測試的6種病原真菌均無抑制活性；此外其對所測試的豆蚜也無毒殺活性。后期將繼續對青霉屬真菌Penicilliumsp.1502產生的次級代謝產物生物活性進行進一步研究，以期為青霉屬來源的次級代謝產物在農用方面的研究提供依據。