果蔬尾菜酵素發(fā)酵條件與生物活性探究

王一賀，田少騰，靳金博，南松劍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670）

尾菜是指蔬菜在生長(zhǎng)、采收、加工等環(huán)節(jié)中產(chǎn)生的廢棄葉、根、莖等，也稱“蔬菜廢棄物”。2020年，中國(guó)蔬菜種植面積約為21.3萬(wàn)km2，蔬菜產(chǎn)量約為7.22億t。隨著中國(guó)果蔬種植的發(fā)展，尾菜也在不斷增加，各類蔬菜在生產(chǎn)過(guò)程中尾菜的平均比例為33.6%，廚房加工過(guò)程中平均廢棄率為20.5%［1］。目前，產(chǎn)地尾菜的處理方法以深埋、遠(yuǎn)倒為主，也有沼氣處理、漚肥等［2］，但由于處理技術(shù)存在不足，與生產(chǎn)實(shí)際差距較大，并且投入的人力和物力過(guò)多，應(yīng)用推廣難度較大［3］。尾菜若不及時(shí)收集處理，會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染［4］。通過(guò)堆肥發(fā)酵處理，可使其作為廢棄物得以資源化利用［5，6］，發(fā)揮其具有的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［7］。利用發(fā)酵的手段將果蔬尾菜轉(zhuǎn)化為酵素，也是尾菜資源化利用的一個(gè)較好辦法，發(fā)酵制得的酵素中不僅含大量的氨基酸、礦物質(zhì)、功效酶等成分［8，9］，而且含有大量作物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)［10］。因酵素具有的良好生物活性［11］，經(jīng)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，酵素在種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)都可以發(fā)揮重要作用［12-14］。

研究表明，桑椹酵素發(fā)酵過(guò)程中添加混合菌種群可以顯著提高特征酶活力［15］，有助于加速發(fā)酵過(guò)程，提高發(fā)酵質(zhì)量［16］；施用EM菌劑有效促進(jìn)番茄、草莓生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量及品質(zhì)［17，18］；添加蔬菜類酵素發(fā)酵的濾液中含有較多霉菌，水果類酵素中含有多種酶類，其成分含量有所不同［19］。本研究通過(guò)對(duì)果蔬廢棄物進(jìn)行不同條件下的發(fā)酵試驗(yàn)，探究不同發(fā)酵條件下對(duì)產(chǎn)物細(xì)菌、真菌和大腸桿菌菌落總數(shù)，pH、密度等指標(biāo)，纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等功效酶活性的影響，分析果蔬酵素制備影響因素，從而優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定最優(yōu)發(fā)酵因子組合，為尾菜發(fā)酵在生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用果蔬尾菜來(lái)源于牟平某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，包括蔬菜廢棄物（因貨架銷售要求需整形、包裝產(chǎn)生的廢棄蔬菜莖、葉、根，主要品種為菠菜、油菜）、水果廢棄物（紅富士蘋果壞果、果皮）；紅糖（EM菌培養(yǎng)適用型）、EM菌劑（混合型添加劑，地衣芽孢桿菌Ⅵ型）購(gòu)于河南農(nóng)富康生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開始前將收集的果蔬尾菜清洗后，置于通風(fēng)處自然晾干水分，消毒處理并切成1～3 cm的小塊（段），裝入清洗消毒過(guò)的不銹鋼發(fā)酵裝置中，按照料液比3∶10進(jìn)行處理，加入發(fā)酵底物、添加物（EM菌劑、紅糖）發(fā)酵。攪拌混合均勻后，添加不同果蔬尾菜發(fā)酵底物、添加物（EM菌劑、紅糖）后密封發(fā)酵。試驗(yàn)開始后每2天將果蔬尾菜酵素?fù)u勻1次，發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為25℃，恒溫發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)生氣體自動(dòng)通過(guò)U型管排出發(fā)酵裝置。

試驗(yàn)共分10組處理，1組為空白處理，其余試驗(yàn)處理具體成分和試驗(yàn)條件見表1。

表1 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

分別于發(fā)酵試驗(yàn)開始后的7、14、21、28、35、42、49 d取樣，使用移液管量取果蔬尾菜酵素上清液50 mL，置于消毒玻璃瓶，4℃冰箱保存并進(jìn)行項(xiàng)目檢測(cè)，項(xiàng)目測(cè)定方法見表2。

表2 項(xiàng)目測(cè)定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2019、SPSS 18.0軟件，采用LSD法作多重比較分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵素發(fā)酵過(guò)程中pH、密度的變化

發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化是判斷發(fā)酵規(guī)律和效果的依據(jù)之一，發(fā)酵過(guò)程中pH的變化見圖1。發(fā)酵初期，各發(fā)酵處理pH變化幅度大，除T8外，其余發(fā)酵處理7 d內(nèi)酵素pH均快速降至4.50以下。在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，各發(fā)酵處理pH變化幅度大幅下降，T1、T6、T7、T8的pH略微升高，T2、T3、T4、T5、T9的pH略微下降，空白處理總體保持穩(wěn)定，pH基本不變。僅添加EM菌劑的發(fā)酵處理發(fā)酵過(guò)程中pH上升，僅添加紅糖及同時(shí)添加紅糖、EM菌劑發(fā)酵處理發(fā)酵過(guò)程中pH下降。其原因可能是菌群生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)消耗分解果蔬尾菜中的有機(jī)酸等物質(zhì)，導(dǎo)致pH升高，添加糖可以增加酵素中的有機(jī)酸等物質(zhì)含量，減緩消耗速度，抑制pH的升高；同時(shí)添加紅糖、EM菌劑的T2、T4、T5分別為相同發(fā)酵底物中pH最低的發(fā)酵組，說(shuō)明同時(shí)添加紅糖、EM菌劑時(shí)，發(fā)酵效果最佳。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中pH變化

不同添加物對(duì)底物為蔬菜廢棄物的發(fā)酵處理影響見圖2，對(duì)比T5、T8、T9，發(fā)酵7 d后，T8的pH從6.17上升至6.59，而T5、T9的pH分別從3.85、4.25下降至3.59、3.85。分析發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)酵底物（蔬菜廢棄物）情況下，T8未添加紅糖，發(fā)酵過(guò)程中pH顯著高于其他處理，推測(cè)該發(fā)酵處理中EM菌劑與蔬菜發(fā)生反應(yīng)生成的物質(zhì)、環(huán)境抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，導(dǎo)致其發(fā)酵效果不佳。

圖2 添加物對(duì)pH的影響

發(fā)酵過(guò)程中酵素密度變化見圖3，除空白處理緩慢下降外，不同發(fā)酵處理密度隨時(shí)間變化均呈明顯下降趨勢(shì)，49 d時(shí)，T2、T3、T4、T5、T8、T9均明顯低于1.000，推測(cè)果蔬尾菜酵素發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)密度小于1.000，可能產(chǎn)生乙醇等密度較小的發(fā)酵產(chǎn)物，說(shuō)明這些發(fā)酵處理效果良好。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中酵素密度變化

2.2 酵素發(fā)酵過(guò)程中菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)是在一定條件下單位體積或者單位質(zhì)量樣品生長(zhǎng)出的細(xì)菌、真菌、大腸桿菌等菌落總數(shù)。果蔬尾菜酵素制備時(shí)，可通過(guò)測(cè)定菌落數(shù)量表示其發(fā)酵程度。發(fā)酵過(guò)程中各處理組真菌菌落總數(shù)變化見圖4，發(fā)酵過(guò)程各處理真菌總數(shù)不斷上升，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2真菌菌落總數(shù)顯著高于其余組處理，為3.25×105cfu/mL，較空白處理增幅為157.94%。說(shuō)明料液比為3∶10，添加紅糖（100 g/L）、EM菌劑（3 mL/L）時(shí)發(fā)酵效果最佳。49 d時(shí)，T1、T3真菌菌落總數(shù)分別較空白處理提升57.14%、30.95%，提升效果顯著，說(shuō)明添加EM菌劑或紅糖均對(duì)發(fā)酵過(guò)程有顯著促進(jìn)作用，添加EM菌劑較添加紅糖對(duì)發(fā)酵過(guò)程中真菌菌落總數(shù)的促進(jìn)作用更為顯著；T2、T4、T5真菌菌落總數(shù)分別為空白處理的257.94%，143.65%，77.46%，說(shuō)明發(fā)酵底物為水果廢棄物時(shí)發(fā)酵效果最佳；比較T1、T6、T7可知，發(fā)酵過(guò)程中真菌菌落總數(shù)與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)EM菌劑添加濃度增大會(huì)抑制其他真菌的增長(zhǎng)。同時(shí)添加紅糖、EM菌劑（3 mL/L）的發(fā)酵處理（T2、T4、T5）為相同發(fā)酵底物真菌菌落總數(shù)最高的處理組，說(shuō)明添加紅糖、EM菌劑時(shí)發(fā)酵效果最佳。添加EM菌劑的發(fā)酵處理（T1、T6、T7、T8）酵素真菌菌落總數(shù)在35 d內(nèi)快速上升，隨后上升速度減緩，42～49 d維持穩(wěn)定，菌落總數(shù)基本不變或略有下降，說(shuō)明添加EM菌劑能夠有效減少發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵至42 d時(shí)，各處理菌落總數(shù)基本穩(wěn)定，為適宜發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。添加紅糖的發(fā)酵處理T3、T9在發(fā)酵35～49 d時(shí)較T1、T6、T7、T8菌落增速不斷增加，菌落總數(shù)快速上漲，說(shuō)明添加紅糖能夠有效增加發(fā)酵時(shí)間。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中真菌菌落變化

發(fā)酵過(guò)程中各處理細(xì)菌菌落總數(shù)變化見圖5，果蔬尾菜酵素含有的細(xì)菌菌落總數(shù)較真菌菌落總數(shù)更多。添加EM菌劑的發(fā)酵處理42～49 d細(xì)菌菌落總數(shù)持續(xù)增加，無(wú)增速下緩趨勢(shì)，與真菌菌落總數(shù)變化有差異。49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2即添加紅糖（100 g/L）和EM菌劑（3 ml/L）發(fā)酵效果最佳，細(xì)菌菌落總數(shù)較空白處理增幅為215.20%。T1、T3細(xì)菌菌落總數(shù)較空白處理分別提升61.01%、52.83%，提升效果顯著；T2、T4、T5細(xì)菌菌落總數(shù)分別為空白處理的316.98%，137.74%，64.78%，說(shuō)明發(fā)酵底物為水果廢棄物時(shí)發(fā)酵效果最佳，細(xì)菌菌落總數(shù)為發(fā)酵底物為蔬菜的489.32%；比較T1、T6、T7可知，隨著EM菌劑添加濃度的增加，發(fā)酵過(guò)程各時(shí)期細(xì)菌菌落總數(shù)呈下降趨勢(shì)，推測(cè)EM菌劑添加濃度增大會(huì)抑制其他細(xì)菌的增長(zhǎng)。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌落變化

發(fā)酵過(guò)程中各處理大腸桿菌菌落總數(shù)變化見圖6，除T8檢測(cè)出含有大腸桿菌外，其余發(fā)酵處理均未檢測(cè)出大腸桿菌，結(jié)合后續(xù)研究推測(cè)，因發(fā)酵過(guò)程中只有T8處理的pH為6.0～7.0，剩余9組處理pH均小于4.5，說(shuō)明果蔬尾菜酵素環(huán)境絕大部分不利于大腸桿菌的生長(zhǎng)。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中大腸桿菌菌落變化

2.3 酵素發(fā)酵過(guò)程中功效酶活性的變化

果蔬尾菜酵素中含有多種功效酶，隨著發(fā)酵過(guò)程中功效酶酶活性不斷上升，酵素作用效果不斷提升。隨著發(fā)酵不斷進(jìn)行，纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶活性均不斷上升，發(fā)酵結(jié)束后各處理酶活性見表3。

表3 發(fā)酵結(jié)束后各處理的酶活性（單位：U/mL）

發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性變化見圖7，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2纖維素酶活性顯著高于其余9組處理，為31.83 U/mL，較空白處理增幅為81.26%，說(shuō)明T2發(fā)酵效果最佳。T1、T3發(fā)酵效果較好，較空白處理增幅分別為51.03%、54.67%，說(shuō)明添加EM菌劑或紅糖均對(duì)發(fā)酵過(guò)程有顯著促進(jìn)作用，且對(duì)于纖維素酶活性影響作用相似；T1、T6、T7纖維素酶活性與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)EM菌劑添加濃度增大會(huì)抑制酶活性的增長(zhǎng)；發(fā)酵底物為蔬菜廢棄物的T5、T8、T9添加不同添加物后，發(fā)酵過(guò)程中酶活性均低于空白處理，纖維素酶活性僅為空白處理的84.00%、77.22%、55.30%，說(shuō)明不同發(fā)酵底物種類對(duì)于酶活性的影響強(qiáng)于添加物對(duì)其影響，水果廢棄物發(fā)酵優(yōu)于蔬菜廢棄物發(fā)酵。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性變化

發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活性變化見圖8，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T2脂肪酶活性顯著高于其余組處理，為0.31 U/mL，較空白處理增幅為138.46%，說(shuō)明T2發(fā)酵效果最佳。T1、T3發(fā)酵效果較好，較空白處理增幅分別為76.92%、130.77%，說(shuō)明添加EM菌劑或紅糖均對(duì)發(fā)酵過(guò)程有顯著促進(jìn)作用，添加EM菌劑較添加紅糖對(duì)發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活性的促進(jìn)作用更為顯著；T1、T6、T7脂肪酶活性與EM菌劑添加濃度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)EM菌劑添加濃度增大會(huì)抑制酶活性的增長(zhǎng)；酵底物為蔬菜廢棄物的T5、T8、T9添加不同添加物后，發(fā)酵過(guò)程中酶活性均低于空白處理，脂肪酶酶活性僅為空白處理的92.30%、61.54%、69.23%，說(shuō)明不同發(fā)酵底物種類對(duì)于酶活性的影響強(qiáng)于添加物對(duì)其影響，水果廢棄物顯著優(yōu)于蔬菜廢棄物發(fā)酵。但考慮到脂肪酶活性較低，僅為0.08～0.30 U/mL，測(cè)量精確度較低，可能導(dǎo)致產(chǎn)生誤差，后續(xù)可進(jìn)行更深入的研究，以期提高精確度。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活性變化

發(fā)酵過(guò)程中α-淀粉酶、蛋白酶活性變化見圖9、圖10，49 d發(fā)酵結(jié)束后，T1至T9相較于空白處理，均無(wú)顯著提升α-淀粉酶、蛋白酶活性，除T5、T8、T9外，不同處理α-淀粉酶活性均在3.0～4.0 U/mL，T1至T4處理較空白處理增幅均在20%以內(nèi)，T5、T8、T9的α-淀粉酶活性顯著低于空白處理，僅為空白處理的59.78%、34.92%、32.96%，說(shuō)明不同發(fā)酵處理之間蛋白酶活性差距較小，蔬菜廢棄物發(fā)酵不利于酵素蛋白酶活性增長(zhǎng)。49 d發(fā)酵結(jié)束后，不同發(fā)酵組蛋白酶活性基本處于5.0～6.0 U/mL，T2處理較空白組增幅最大，也僅為17.1%，各處理組總體差距不大，說(shuō)明不同發(fā)酵底物、不同添加物對(duì)于果蔬尾菜酵素α-淀粉酶及蛋白酶活性影響較小。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中α-淀粉酶活性變化

圖10 發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性變化

3 討論

發(fā)酵過(guò)程中pH的變化可以反映發(fā)酵過(guò)程是否正常，同時(shí)也能反映酵素品質(zhì)，是判斷發(fā)酵成功與否的標(biāo)志［21］。除T8外，49 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，剩余處理組pH均位于3.0～4.0并保持穩(wěn)定，與蔡毅飛［21］、卜俊芝［22］的研究一致，說(shuō)明發(fā)酵試驗(yàn)成功，果蔬尾菜酵素品質(zhì)較好。發(fā)酵過(guò)程中7 d內(nèi)酵素pH迅速下降，后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中pH緩慢變化或保持穩(wěn)定，說(shuō)明發(fā)酵初期各項(xiàng)反應(yīng)較為活躍，發(fā)酵速度較快，發(fā)酵中后期發(fā)酵環(huán)境基本保持穩(wěn)定。發(fā)酵過(guò)程中未添加糖的發(fā)酵處理pH較高，符合張海燕等［23］的研究結(jié)果，說(shuō)明酵素中糖添加量過(guò)低會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。發(fā)酵過(guò)程中，酵素密度低于1.00，推測(cè)酵母菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生醇類、醛類［24］、酸類［25］等物質(zhì)，且隨著醇類、醛類、酸類等物質(zhì)濃度的增加，酵素密度不斷降低［26］。

菌落總數(shù)為微生物指示性指標(biāo)之一，可在一定程度上反映生產(chǎn)過(guò)程中的發(fā)酵程度。本研究通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵結(jié)束后不同處理尾菜酵素中真菌、細(xì)菌菌落總數(shù)含量普遍達(dá)到7×105cfu/mL以上，該結(jié)論與文浩等［25］、何曼等［27］的研究結(jié)果相似，說(shuō)明試驗(yàn)果蔬尾菜酵素發(fā)酵良好。添加EM菌劑處理組細(xì)菌、真菌菌落顯著高于其他處理組，與位伯華［28］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明尾菜酵素添加EM菌劑可顯著增加真菌、細(xì)菌菌落總數(shù)，發(fā)酵程度良好。

酵素通常因含有多種功效酶可有效進(jìn)行資源化利用，本研究對(duì)酵素的纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶及α-淀粉酶的酶活性進(jìn)行測(cè)定，分析說(shuō)明酵素中功效酶含量較高，與饒毅萍等［29］的研究一致。4種功效酶的含量差距較大，其中纖維素酶相對(duì)活力最高，脂肪酶相對(duì)活力最低，與周新萍等［19］、張海燕等［23］和陳爽等［30］的研究結(jié)果相似，而蛋白酶酶活力較低，與蔡毅飛［21］的研究結(jié)果蛋白酶的相對(duì)活性最高不一致，推測(cè)可能與試驗(yàn)采用的原料不同且試驗(yàn)所選用原料相對(duì)單一有關(guān)。

4 結(jié)論

果蔬尾菜酵素具有相對(duì)穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境，但不同發(fā)酵階段中，微生物的種類和數(shù)量發(fā)生變化，各種反應(yīng)和微生物之間的相互影響，導(dǎo)致各項(xiàng)指標(biāo)在一定區(qū)間內(nèi)動(dòng)態(tài)變化。絕大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵底物為水果廢棄物，料液比為3∶10，添加紅糖（100 g/L）與EM菌劑（3 ml/L）時(shí)發(fā)酵效果最佳，菌落總數(shù)、pH密度等多項(xiàng)指標(biāo)較空白發(fā)酵組均有顯著提升。對(duì)果蔬尾菜酵素發(fā)酵過(guò)程中功效酶活性（纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，酵素發(fā)酵過(guò)程中，在不同因素影響下，酵素密度不斷下降，pH在一定區(qū)間內(nèi)保持穩(wěn)定變化；菌落總數(shù)不斷上升，含有一定數(shù)量的真菌、細(xì)菌，大部分不含大腸桿菌；功效酶活性不斷增加，纖維素酶活性較高，含有一定數(shù)量的α-淀粉酶及蛋白酶，脂肪酶酶活性較低。在發(fā)酵底物不同的情況下，酵素的微生物數(shù)量，酶活性存在較大差異。