中藥喹諾酮類藥物耐藥抑制劑篩選

張 靜，范葶莉，穆春雨

（滄州職業技術學院畜牧獸醫系，河北 滄州 061000）

近年來，由于抗微生物藥物的廣泛及不合理應用，大量細菌產生了耐藥性，這導致藥物臨床療效的降低，甚至無效，感染畜禽的發病率和死亡率明顯升高。中藥是我國的天然資源，具有資源廣、毒副作用低等特點，因此，在中藥中篩選耐藥抑制劑具有廣泛的應用價值和良好的開發前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬源大腸桿菌耐藥菌 A-3，由本研究室分離鑒定并保存；標準大腸桿菌質控菌ATCC 25922，購自中國獸藥監察所。

1.1.2 藥品 鹽酸環丙沙星，含量為 98.1 %，批號 211101；中藥材：五倍子、胡椒、細辛、山楂、金銀花、牡丹皮等30味中藥材。

1.1.3 培養基及試劑 培養基：LB培養基，批號 100311；麥糠凱瓊脂培養基，批號 100414；試劑：95 % 乙醇，TTC。

1.1.4 儀器設備 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器：金壇市金城國勝實驗儀器廠；旋轉蒸發儀：德國 Heidolph；微量移液器：德國eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品儲備液的制備 鹽酸環丙沙星儲備液：鹽酸環丙沙星用滅菌水配成 5 120 μg/ml，經過濾除菌后，保存于 4 ℃ 冰箱備用。中藥儲備液：30味中藥分別用乙醇回流2次，濾液合并、減壓濃縮、離心后定容至生藥濃度為 1 g/ml，此為醇提液，剩余藥渣再水煎 2次，合并 2次煎液，濃縮離心定容至生藥濃度為 1 g/ml，此為水煎劑。均過濾除菌后保存于4 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 鹽酸環丙沙星及中藥提取物最低抑菌濃度（MIC）測定 MIC測定具體方法：采用試管 2倍稀釋法進行，將培養過夜的大腸桿菌 A-3菌鹽酸環丙沙星 MI液用肉湯做 500~1 000倍稀釋，校正菌液濁度至 0.5麥氏單位，標準鹽酸環丙沙星儲備藥液做5倍稀釋后再將藥液倍比稀釋9個梯度，濃度依次為 512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/ml，每管依次用微量移液器加入稀釋后的菌液 100 μl，每組設陰性對照組、陽性對照組以及空白對照，加液完畢后，充分震蕩混勻，于 37 ℃ 培養箱培養 16~18 h。藥品作雙樣品測定，記錄無菌生長的最低濃度為鹽酸環丙沙星MIC。

中藥提取物MIC測定具體操作方法參照鹽酸環丙沙星。若因中藥提取液顏色太深或是中藥與營養肉湯發生反應而出現沉淀現象影響 MIC讀取，應采用滴加TTC或平板劃線培養再做觀察。

1.2.3 中藥耐藥抑制劑的篩選 選取無抑菌效果的中藥提取物，直接等體積加入已經倍比稀釋 5個梯度的鹽酸環丙沙星中，并設置對照。加液完畢后，充分震蕩混勻，于培養箱 37 ℃ 培養 16~18 h。每種藥物作雙樣品測定，記錄無菌生長的最低濃度，觀察加入中藥提取物以后，鹽酸環丙沙星的最小抑菌濃度是否會發生變化。取剩余有抑菌作用的中藥提取物，用營養肉湯稀釋至亞抑菌濃度后，等體積加入到已經倍比稀釋 5個梯度的鹽酸環丙沙星中，并設置對照。加液完畢后，充分震蕩混勻，于培養箱 37 ℃ 培養 16~18 h。每種藥物作雙樣品測定，記錄無菌生長的最低濃度，觀察加入中藥提取物以后，鹽酸環丙沙星的最小抑菌濃度是否會發生變化。

2 結果與分析

2.1 鹽酸環丙沙星及中藥提取物抑菌效果

鹽酸環丙沙星對大腸桿菌 ATCC25922的MIC 為 2 μg/ml，對臨床分離大腸桿菌 A-3的MIC為 512 μg/ml，即 A-3對乳酸環丙沙星表現出了高水平耐藥。

從30味60種中藥的水煎劑與醇提液中篩選出對大腸埃希菌有抑菌作用的有牡丹皮醇提與水煎劑、山楂醇提液與水煎劑、金銀花醇提液與水煎劑等 45種中藥提取物（見表 1）。本試驗所選中藥中，以胡椒和山楂醇提液抑菌活性最強，其MIC為 31.25 mg/ml，而山楂水煎劑也表現出良好的抑菌作用，其MIC為62.5 mg/ml。

表1 單味中藥提取物對耐藥菌株A-3和質控均株ATCC25922 MIC （mg/ml）

部分中藥提取物的水煎劑和醇提液的抑菌效果不同，其中淫羊藿、夏枯草的水煎劑具有抑菌作用而醇提液無抑菌作用；茵陳、馬鞭草等 3味中藥的醇提液具有抑菌效果而水煎劑無抑菌作用，但抑菌范圍均在250~500 mg/ml范圍內。

所選 60種中藥提取物中，臨床分離多重耐藥大腸桿菌 A-3對蒼耳子水煎劑、天仙子醇提液與水煎劑、藿香水煎劑、桑白皮醇提液 4種中藥提取物產生了耐藥性，其中以蒼耳子水煎劑最為嚴重，其對質控大腸埃希菌MIC為7.8125 mg/ml而對耐藥菌MIC為250 mg/ml。臨床分離菌對其他中藥提取物并未產生耐藥，MIC基本一致。

2.2 中藥提取物聯合鹽酸環丙沙星抑菌效果

本試驗采用中藥提取物與鹽酸環丙沙星聯合應用，通過觀察鹽酸環丙沙星對高水平耐藥菌株大腸桿菌 A-3的 MIC是否存在影響來判斷該中藥提取物對大腸桿菌的耐藥性是否存在抑制作用，其中地黃等 42種中藥取物與鹽酸環丙沙星聯用后，鹽酸環丙沙星對耐藥大腸桿菌 A-3 MIC大于 512 μg/ml，表現為拮抗作用；桑白皮等 16種中藥提取物與鹽酸環丙沙星聯用后，鹽酸環丙沙星對耐藥大腸桿菌A-3MIC等于512 μg/ml；而細辛中藥提取物與鹽酸環丙沙星聯用，可使其MIC下降8倍，表現出良好的耐藥抑制作用（見表 2）。

表2 添加細辛提取物后鹽酸環丙沙星對耐藥菌株A-3 MIC變化 （μg/ml）

3 討論

3.1 中藥有效成分提取

就傳統中藥提取工藝而言，中藥有效成分的提取包括水提法和醇提法：其中熱水浸提法即煎煮法，為中藥有效成分提取最常用的方法之一；乙醇提取法適用于含雜質較多的藥材，乙醇提取法又分為滲漉法和回流法。而現代提取分離技術包括膜分離技術、超臨界流體萃取法、超微粉碎技術、分子蒸餾法、超聲提取法等。本試驗采用傳統中藥提取法聯合應用，首先采用醇提法，在此基礎上再采用水煎法，每一味中藥材經過 2種處理方法均得到 2種中藥有效成分提取液，最大限度的保證了藥品成分不丟失。

3.2 中藥對大腸桿菌的抑菌作用

研究證實單味中藥及一些復方中藥在抗菌方面具有獨特優勢。抗菌中藥有著廣泛的篩選范圍，如清熱解毒藥、瀉下藥、補虛藥、理血藥等。2020年，向雙云等檢測了黃芩、五味子、黃柏等 8種中草藥對大腸桿菌的抑制作用，結果發現其中黃連、魚腥草、五味子和艾草 4種中藥對大腸桿菌表現出較強的的抑菌效果[1]。2021年，胡安古麗·努爾別克等試驗發現，駱駝蓬子、沒食子對犢牛腹瀉致病菌有較好的抑菌作用[2]。本試驗選取的30味常見中藥中有45種中藥提取物對臨床分離耐藥大腸桿菌存在抑菌作用，除蒼耳子水煎劑、桑白皮醇提液、天仙子醇提液與水煎劑、藿香水煎劑 4種中藥提取物產生了耐藥性外，耐藥大腸桿菌對其余中藥提取物均不存在耐藥性，表明應用中藥提取物發揮抑菌作用存在很大優勢。

3.3 中藥逆轉大腸桿菌耐藥

由于抗微生物藥物的廣泛應用甚至濫用，臨床分離大腸桿菌對多種抗微生物藥物均產生了耐藥，本研究室通過對 2021年滄州地區臨床分離大腸桿菌的敏感性試驗，其中對恩諾沙星、環丙沙星的耐藥率分別為 79.45 %、70.09 %。為解決細菌耐藥性帶來的影響，2015年，司紅彬等人通過白頭翁水提取物與抗菌藥聯合抗含耐磷霉素基因型和超廣譜 β-內酰胺酶型大腸埃希菌體外研究，表明白頭翁水提取物與 13種抗菌藥聯合使用，可增強抗菌藥抗菌活性，降低抗菌藥MIC[3]。2018年，王莉貞等研究發現倒扣草水煮液與部分抗菌藥聯用可降低抗菌藥對多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度[4]。2020年，劉超怡等人探究了艾葉對大腸桿菌的耐藥消除作用，試驗發現艾葉提取物在一定程度上能夠消除禽源大腸桿菌的耐藥性[5]。

本試驗通過對臨床常見 30味中藥材的水煎劑與醇提液與環丙沙星聯合試驗發現，細辛具有耐藥抑制作用，細辛提取物在很大程度上可能是一種天然的外排泵抑制劑，而具體是哪一種成分有效還需進一步分離驗證；除此，存在地黃等42種中藥取物其與鹽酸環丙沙星聯用后，鹽酸環丙沙星對耐藥大腸桿菌 A-3的 MIC大于512 μg/ml，表現為拮抗作用，這說明，盡管目前中西藥結合抑菌是國內研究的一個熱點，但是多數中藥材與喹諾酮類藥物聯用，表現為拮抗作用，臨床應慎用，而其具體拮抗機制有待研究。