熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠免疫機能的影響

魏可鋒，李 可, 于忠芳, 馮玉祥, 蘇 越，馬衛明，閆振貴*

（1.山東省畜牧業貿易服務中心有限公司，山東 濟南 250000；2.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安）

益生菌（probiotics）廣泛存在于自然界和動植物體內，能分泌多種代謝產物，對宿主具有廣泛的益生作用。枯草芽孢桿菌作為一種芽孢桿菌屬益生菌，具有環境適應性強，安全性高，用途廣泛等特點[1]。有研究表明，部分失去活性的益生菌仍能發揮活菌體原有的益生功能，并且在制備運輸、安全性、臨床應用等方面較活菌具備更大的優勢，可廣泛用于功能性食品、臨床治療、飼料添加等各個領域，具有極大的研究價值[2-3]。目前，日本、美國等對滅活益生菌的應用已形成了一定的產業規模[4]，而國內相關益生菌的研究則主要集中在活菌上，對滅活菌功能和應用的研究還比較少。因此，本研究利用熱滅活枯草芽孢桿菌灌服小鼠，評估其對小鼠免疫機能的作用，為相關滅活益生菌制劑的開發和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及動物 枯草芽孢桿菌，由山東青島根源生物公司提供，批號 W161041；SPF級昆明種小鼠，體重 18～22 g，購自山東泰邦生物制品有限公司。

1.1.2 主要試劑及溶液 谷丙轉氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）生化試劑板購自北京安普生化有限公司；IL-2、IFN-γ ELISA 試劑盒由上海恒遠生物科技有限公司提供；RIPA高效組織裂解液購自北京索萊寶公司、總 RNA提取試劑盒購自北京康為公司、M5 Super qPCR RT Kit、2×Fast Super EvaGreen? qPCR Mastermix購自US Everbright公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 滅活枯草芽孢桿菌菌液制備 枯草芽孢桿菌接種于 LB肉湯中，37 ℃ 振蕩培養 12 h，培養 3代后用菌落平板計數法計算菌液濃度。隨后在高壓滅菌鍋中滅活40 min，PBS重懸備用。

1.2.2 試驗動物及分組 小鼠適應性喂養 3 d后隨機分將成 5組，每組 4只，按照如下方式處理：空白對照組 BC（PBS），活菌對照組 VC（107CFU/ml活菌），低劑量（IV-L）、中劑量（IV-M）、高劑量（IV-H）滅活菌組（106、107、108CFU/ml滅活菌）。每只小鼠每天灌服菌液或PBS 0.3 ml，試驗期間自由采食飲水，于灌胃7 d和14 d時處死小鼠，采集樣品進行后續試驗。

1.2.3 小鼠血清肝腎生化指標測定 眼眶采血后離心獲取小鼠血清樣本，使用生化分析儀檢測樣品血清ALT、BUN、CREA的含量。

1.2.4 小鼠全血淋巴細胞數及中性粒細胞數測定眼眶采血收集小鼠全血樣本，使用三分類血球分析儀檢測各樣本淋巴細胞和中性粒細胞數。

1.2.5 小鼠脾指數測定 小鼠稱重后在無菌環境中采集脾組織，清除表面結締組織后稱重。脾指數（%）= 脾重量（mg）/體重（g）×100 %。

1.2.6 小鼠血清細胞因子含量測定 收集小鼠血清樣本，根據酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書測定血清中IL-2和IFN-γ含量。

1.2.7 小鼠脾組織 IL-2 mRNA表達量的測定使用RNA提取試劑盒提取脾組織樣本總RNA并將其反轉錄成 cDNA。隨后使用 Light-Cycler 96熒光定量PCR儀擴增樣本cDNA，評估溶解曲線并記錄各反應Ct值。試驗結果以2-△△ct值表示，β-actin為內參基因校準表達。反應條件為 95 ℃持續 30 s；40 個循環：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s。引物序列為：IL-2 上游：5'-CTGGAGCAGCTGTTGATG-3'，下游：5'-CGA ATTGGCACTCAAATG-3'；β-actin 上游：5'-TGC TGTCCCTGTA TGCCTCT-3'，下游：5'-GGTCTT TACGGATGTCAACG-3'。

1.2.8 數據處理 試驗結果以均值±標準差表示。組間比較使用 one-way ANOVA分析，并用Tukey's法檢驗。P<0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠肝腎生化指標的影響

由表1可見，灌胃7 d與14 d時活菌組和滅活菌組的血清 ALT、BUN和 CREA含量未出現明顯波動，且絕大部分試驗組指標與 BC組無顯著差異（P>0.05），表明試驗周期內滅活枯草芽孢桿菌對小鼠肝腎生化指標無顯著影響，具有較高的安全性。

表1 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠血清ALT、BUN、CREA含量的影響（n=4）

2.2 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠脾指數的影響

由圖1可見，灌胃7 d時，IV-M組脾指數顯著高于 BC組（P<0.05）；灌胃 14 d時，IV-L和IV-M組脾指數均高于BC和VC組，但差異不顯著（P>0.05），表明中劑量滅活枯草芽孢桿菌提高小鼠脾指數效果較明顯。

圖1 各組脾指數的變化

2.3 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠全血淋巴細胞數和中性粒細胞數的影響

由表2可見，灌胃7 d和14 d時，IV-M和IV-H組血液淋巴細胞數顯著高于 BC組（P<0.05）；滅活菌各組中性粒細胞數均高于 BC組，且 IV-H組具有顯著性（P<0.05）。這表明高劑量滅活枯草芽孢桿菌能有效提高小鼠血液中性粒細胞和淋巴細胞數。

表2 全血淋巴細胞和中性粒細胞數（×109個/L）（n=4）

2.4 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠血清 IL-2和IFN-γ含量的影響

由圖2可見，灌胃7 d和14 d時，IV-H組血清 IL-2含量顯著高于 BC和 VC組（P<0.05）；與BC組相比，灌胃14 d時IV-L組血清IFN-γ含量顯著升高（P<0.05），說明灌服相應濃度的熱滅活枯草芽孢桿菌能顯著促進小鼠血清中IL-2和IFN-γ的分泌。

圖2 各組血清IL-2和IFN-γ含量變化

2.5 熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠脾組織 IL-2 mRNA表達水平的影響

由圖3可見，灌胃7 d時，與BC組相比，IV-M、IV-H組和VC組IL-2 mRNA表達水平顯著增加（P<0.05）；灌胃 14 d時，IV各組和 VC組 IL-2 mRNA水平均顯著高于 BC組（P<0.05），這與血清IL-2含量的檢測結果基本符合。

圖3 各組小鼠IL-2 mRNA相對表達量的變化

3 討論

近年來隨著人們對枯草芽孢桿菌研究的深入，其更多的特性進入了人們的視野。有研究報道枯草芽孢桿菌能提高宿主機體免疫細胞的數量和活性，并激發后續的體液和細胞免疫，可作為一種良好的免疫激活劑[5]。益生菌的細胞壁成分、代謝產物、菌體細胞等均能刺激動物腸道黏膜免疫系統[6]，其中胞壁含有的肽聚糖和外膜蛋白以及菌體代謝產物中游離脂肪酸和細菌素等能增強小鼠巨噬細胞和B淋巴細胞活性，促進IL-2和 IFN-γ等免疫活性因子分泌[7]。此外，熱滅活枯草芽孢桿菌還能刺激腸道黏膜中的B細胞活化，促進局部免疫球蛋白的分泌，增強免疫功能[8]。

免疫器官是機體免疫系統重要的組成部分，評估免疫器官發育情況可以間接評估機體免疫機能。脾臟作為機體內最大的外周免疫器官，是各種淋巴細胞和巨噬細胞的聚集地，血液中大部分抗原在此被捕獲和處理[9]。另外，血液中的 T細胞、B細胞、NK細胞等淋巴細胞是機體重要的免疫細胞，它們在發揮體液免疫、細胞免疫、免疫信號傳導和調控等方面發揮重要的作用。此外，細胞因子在機體免疫反應過程中同樣具有重要的作用。研究表明，部分細胞因子能參與T細胞的激活，后者又能促進多種細胞因子的分泌，構成機體復雜的免疫調控網絡[10]。在這些細胞因子中，IL-2能刺激 B細胞增殖、分化和抗體分泌，誘導 NK和 LAK等多種殺傷細胞活化[11]。IFN-γ 則能提高巨噬細胞和 NK 細胞的活性，增強IgG Fc片段受體表達。檢測這些細胞因子的分泌和表達有助于評估機體的免疫應答水平。

本試驗首先對熱滅活枯草芽孢桿菌的安全性進行了評估，避免后續試驗對宿主產生毒害作用。與先前報道一致，枯草芽孢桿菌安全性高，對宿主機體無明顯毒害作用[12]。隨后檢測了多種免疫相關指標，來探究熱滅活枯草芽孢桿菌對小鼠免疫機能的作用。結果顯示，熱滅活枯草芽孢桿菌提高了小鼠脾指數、全血免疫細胞數和細胞因子表達分泌量，對小鼠免疫機能起到有益的調節作用。有趣的是，在部分指標中，滅活菌相較活菌具有更顯著的益生作用，可能的原因是滅活菌液中枯草芽孢桿菌以芽孢體為主，芽孢體形態的細菌表面有更多的抗原位點，能被機體免疫細胞更迅速的識別，從而引起廣泛和高效的免疫反應[13]。此外，枯草芽孢桿菌在疫苗佐劑方面同樣具有應用價值。鄧軍發現傳染性胃腸炎病毒疫苗中加入枯草芽孢桿菌可以使仔豬血清中特異性抗體額外增加[14]。盡管關于枯草芽孢桿菌是否能用于免疫佐劑和口服疫苗尚無明確定義，但枯草芽孢桿菌及其滅活微生態制劑具有的免疫調節作用值得關注。

4 結論

本研究表明，熱滅活枯草芽孢桿菌能通過提高小鼠脾指數、全血免疫細胞數和細胞因子表達分泌量等方式發揮免疫增強作用，可能是一種安全有效的免疫增強劑。然而，由于動物模型的限制，熱滅活枯草芽孢桿菌免疫增強的具體作用機制有待進一步研究。