一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定青皮中5 種成分的含量

鄺敏賢，潘弟儀，陳用年，劉少君

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360

青皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮。《中國(guó)藥典》2020 年版將青皮分為“個(gè)青皮”和“四花青皮”兩種不同的規(guī)格［1-2］。自然掉落于5～6 月的幼果，采集晾干后，俗稱“個(gè)青皮”；采摘于7～8月份未成熟的果實(shí)，在果皮上縱剖成4 瓣至基部，切去瓤，干燥后，被稱為“四花青皮”。青皮味苦、辛，性溫，具有破氣行痰、消痞除滿、理氣健脾、燥濕化痰等功效，用于治療胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳癖、乳癰、食積氣滯、脘腹脹痛等病癥［3］。如廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱我院）中醫(yī)外科，醫(yī)師多利用青皮破氣、消痞等功效來治療婦人乳腺方面的疾病。現(xiàn)代藥理研究表明，青皮具有去痰平喘、利膽、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗休克、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等活性［4-6］。青皮主要含有揮發(fā)油、黃酮類和生物堿類等成分，其中黃酮類成分主要為橙皮苷、蕓香柚皮苷、橘皮素等，是其有效成分。2020 年版《中國(guó)藥典》一部青皮項(xiàng)下只將橙皮苷作為指標(biāo)成分，用于對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)的控制［1］。目前國(guó)家公示的青皮配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，在特征圖譜項(xiàng)下規(guī)定了辛弗林、蕓香柚皮苷、橘皮素等7個(gè)特征峰。說明青皮中至少含有這7 個(gè)成分。

一測(cè)多評(píng)法（QAMS）確定其他成分與內(nèi)參照物間的相對(duì)校正因子（RCF），利用內(nèi)參照物含量和RCF 可以通過計(jì)算得到其他成分的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材中多個(gè)成分的含量結(jié)果的同時(shí)測(cè)定，QAMS 已逐漸應(yīng)用于中藥材和中成藥制劑的質(zhì)量控制中［7-9］。本研究通過建立QAMS，以橙皮苷為內(nèi)參照物，同時(shí)測(cè)定青皮中辛弗林、蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素5 種化學(xué)成分的含量，以期進(jìn)一步優(yōu)化青皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為我院采購(gòu)和驗(yàn)收青皮藥材或飲片及后續(xù)院內(nèi)制劑研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型超高效液相色譜儀（安捷倫）；Waters Acquity 型超高效液相色譜儀（沃特世）；Eco-S15 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器）；Quintix系列分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

橙皮苷（批號(hào)：110721-201818，純度96.2%），辛弗林（批號(hào)：110727-201809，純度99.5%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。蕓香柚皮苷（批號(hào)：wkq19041908，純度≥98%），川陳皮素（批號(hào)：wkq20031701，純度≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。橘皮素（批號(hào)：151021，純度98%以上）來自成都普菲德生物技術(shù)。甲醇、乙腈等純度為色譜純（Merck 公司）；甲酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；水使用超純水，其他試劑純度為分析純。10 批青皮藥材均符合2020 年版《中國(guó)藥典》一部青皮項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3］

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～2 min，1%→8% A；2～5 min，8%→13% A；5～12 min，13%→19% A；12～13 min，19%→22% A；13～20 min，22%→35% A；20～21 min，35%→51% A；21～30 min，51%→54% A；30～31 min，54%→1% A；31～35 min，1% A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和橘皮素對(duì)照品適量，置20 mL 量瓶中，加10%甲醇溶解并定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為540.261 6、23.417 6、53.277 5、21.196 3、17.751 2 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取青皮藥材細(xì)粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，取出，放冷，再次稱定重量，用10%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加10%甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到各待測(cè)組分的回歸方程及線性范圍見表1。可知5 個(gè)成分于相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為0.73%、0.76%、0.46%、0.32%、0.30%，表明儀器的精密度良好。

圖1 專屬性考察UPLC色譜圖：A.空白溶劑；B.供試品溶液；C.混合對(duì)照品溶液

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取青皮樣品適量，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為1.28%、1.40%、0.46%、1.74%、2.06%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取青皮樣品適量，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰峰面積的RSD 分別為1.75%、2.48%、1.00%、1.50%、1.08%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次成分含量已知的青皮樣品9 份，每份取約0.1 g，分為3 組，每組分別按高、中、低濃度精密加入混合對(duì)照品溶液。按“2.3”項(xiàng)下的方法制備得到供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，記錄各自峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率及對(duì)應(yīng)的RSD。結(jié)果見表2，辛弗林、蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的平均回收率及RSD 分別為101.05%（RSD 2.82%）、96.01%（RSD 2.92%）、96.93%（RSD 1.73%）、94.01%（RSD 2.78%）、103.86%（RSD 2.00%）。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 青皮中5種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 （續(xù)）

2.5 相對(duì)校正因子的確定［10-11］

精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以橙皮苷為內(nèi)參照物，以各自的峰面積和質(zhì)量濃度，代入公式計(jì)算，得其余4 種成分的相對(duì)校正因子（fs/k），公式為fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs），其中As為 內(nèi)參照物峰面積，Cs為內(nèi)參照物質(zhì)量濃度，Ak為待測(cè)成分峰面積，Ck為待測(cè)成分質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對(duì)校正因子

2.6 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性研究

2.6.1 不同品牌色譜儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響［12］以橙皮苷為內(nèi)參照物，考察其他4 種成分在Agilent 1260 型、Waters Acquity 型兩種高效液相色譜系統(tǒng)，以及沃特世ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），安捷倫ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）等三種色譜柱下的相對(duì)校正因子（RCF），結(jié)果見表4，表明不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)各成分RCF 無顯著影響。

表4 不同品牌色譜儀、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫ZORBAX SB-C18 色譜柱，考察柱溫設(shè)定為25、30、35、40 ℃下對(duì)每種成分的相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表5，不同柱溫條件下4 種成分的RSD 分別為1.48%、1.70%、2.54%、2.62%，均小于3%，表明柱溫對(duì)4 種成分相對(duì)校正因子無顯著影響。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6.3 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫 ZORBAX SB-C18 色譜柱，考察流速0.2、0.3、0.4 mL/min 對(duì)4 種成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表6，不同流速條件下4 種成分的RSD 分別為0.94%、1.17%、1.32%、2.76%，表明不同流速對(duì)各成分相對(duì)校正因子無顯著影響。

表6 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6.4 不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響［12］采用Agilent 1260 型高效液相色譜儀、安捷倫 ZORBAX SB-C18色譜柱，考察進(jìn)樣體積0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL 對(duì)4 種成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表7，各成分的RSD 分別為0.88%、2.35%、2.55%、1.80%，表明進(jìn)樣體積的波動(dòng)對(duì)各成分相對(duì)校正因子無顯著影響。

表7 不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.7 待測(cè)成分色譜峰的定位［13］

在一測(cè)多評(píng)的運(yùn)用中，能否在不同色譜體系中對(duì)待測(cè)組分的色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位是關(guān)鍵，目前常用的色譜峰定位方法有相對(duì)保留值法、保留時(shí)間差法、時(shí)間校正法等。相對(duì)保留值法計(jì)算公式：ti/s=ti/ts。ti為待測(cè)組分保留時(shí)間，ts為內(nèi)參照物保留時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行待測(cè)組分色譜峰的定位，以橙皮苷為內(nèi)參照物，考察其他4 種成分在Agilent 1260 型和Waters Acquity 型兩種高效液相色譜系統(tǒng)，以及3 根不同廠家的色譜柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Agilent ZORBAX SBC18、YMC Triart C18）的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果見表8，采用相對(duì)保留值法各成分的RSD 均小于3%，表明采用相對(duì)保留值法對(duì)待測(cè)成分的定位是可行的。

表8 各成分相對(duì)保留時(shí)間

2.8 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取10 批青皮適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS 測(cè)定5 種成分的含量，利用SPSS 26.0 軟件對(duì)兩組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)及Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果見表9，兩種方法之間的相關(guān)系數(shù)r均為1.00，表明兩種方法測(cè)定結(jié)果具有高相關(guān)性，且兩種方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），建立的一測(cè)多評(píng)法具有較好的可信度。

表9 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)測(cè)定結(jié)果比較

3 討論

本研究對(duì)供試品溶液的提取方式（超聲法、回流法），提取溶劑（10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、10%甲醇、20%甲醇、50%甲醇），提取時(shí)間（30、45、60 min）和稀釋體積（20、50、100 mL）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備得到供試品溶液時(shí)色譜峰的峰面積和分離度均較好。在210～400 nm 內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在275 nm 時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)、噪聲小，各組分的響應(yīng)值較高，因此，選擇275 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

目前，對(duì)青皮的研究主要集中于不同產(chǎn)地、不同規(guī)格等方面［3,14-15］。本次實(shí)驗(yàn)以我院的常用藥材青皮為研究對(duì)象，希望能同時(shí)測(cè)定青皮含有的5 種黃酮類成分。引入一測(cè)多評(píng)法，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察，比較不同成分的峰面積和質(zhì)量濃度得到4 種成分與橙皮苷的相對(duì)校正因子，還使用外標(biāo)法來驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，從而考察一測(cè)多評(píng)法在青皮5 種黃酮類成分的含量測(cè)定上是否具有可行性和可操作性。

結(jié)果表明，使用QAMS 測(cè)得的青皮5 種黃酮類成分的含量與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果沒有明顯差異，證明建立的一測(cè)多評(píng)法可行，具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此方法的建立，可使青皮藥材從單一成分測(cè)定升級(jí)為更多成分測(cè)定，為更全面地評(píng)價(jià)青皮藥材質(zhì)量提供了方法。該方法的建立，能大大提高測(cè)定速度和降低測(cè)定成本，為我院在采購(gòu)及驗(yàn)收青皮藥材或飲片質(zhì)量控制提供參考。