地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合靜脈推注烏司他丁對老年急性肺損傷患者TGF-β1/Smads信號通路的影響

張藝, 胡松華, 朱建新

(河北北方學院附屬第一醫院 藥學部, 河北 張家口 075000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由各種肺內或(和)肺外致病因素所導致的彌漫性肺間質及肺泡水腫，可由肺部感染、嚴重創傷、膿毒癥等引起，屬急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)病理學發展的早期階段，具有起病急、發病嚴重等特點，ALI多并發急性炎癥、微血管損傷，可造成肺血管和上皮細胞通透性增加，如不及時治療可發展為多器官功能衰竭[1-2]。現階段，臨床主要通過治療原發基礎病及繼發性臟器損傷，并采用機械通氣等對ALI進行治療，但這些治療僅能維持患者的肺功能，并不能從根本治療患者呼吸困難的病因[3]。地塞米松是臨床最常用的糖皮質激素，被認為是治療急危重癥患者的良藥，地塞米松可起到抗炎、抗過敏及免疫抑制等作用，常被用于急性胰腺炎、急性循環衰竭的輔助用藥[4]。烏司他丁作為廣譜的蛋白酶抑制劑，有拮抗炎性介質、穩定溶酶體膜和清除氧自由基的作用，適用于多種炎癥性疾病，但其作用機制亦尚未完全明晰[5-6]。有學者發現，機體炎癥、氧化損傷、纖維組織增生及修復在ALI發病進程中扮演著關鍵角色，目前關于地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合烏司他丁治療老年ALI的研究仍鮮有報道，為了探明這一組合方案對老年ALI患者整體療效的影響，本研究選取2019年2月—2021年6月診治的58例老年ALI患者作為研究對象，采用地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合烏司他丁治療，觀察治療期間患者的全身炎癥反應、氧化應激反應及轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smads信號通路的活化情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月—2021年6月診治的116例老年ALI患者作為研究對象，所有受試者均符合參考文獻[7]中ALI的診斷標準。納入標準：(1)未伴有其他相關臟器的器質性病變；(2)入住ICU時急性肺損傷評分(lung injury score,LIS)≥4分；(3)機械通氣治療時間>3 d;(4)入組前3個月未曾應用過糖皮質激素、免疫抑制藥物者，(5)患者家屬簽屬知情同意書。排除標準：(1)地塞米松或烏司他丁藥物過敏者;(2)孕婦及哺乳期婦女;(3)有近期手術史者;(4)患有嚴重心肝腎功能障礙者;(5)存在自身免疫性疾病、神經系統疾病者;(6)血流動力學不穩定者。根據患者入院順序，并按隨機數字表法將患者分為觀察組及對照組，每組58例。

1.2 治療方法

1.2.1對癥治療 入院后2組患者均根據參考文獻[7]給予對癥、營養支持、糖皮質激素、限制性液體管理及抗生素抗感染等治療，實時監測生命體征；給予肺保護性通氣策略，通氣參數設置為小潮氣量通氣水平控制在5～8 mL/kg、呼吸頻率設定為20次/min、吸入氧濃度(fraction of inspiration O，FiO2)為0.35～0.80、平臺壓<35 cmH2O、呼氣末正壓通氣(positive end expiratory pressure,PEEP)水平依靜態P-V曲線+2 cmH2O確定，盡量保持患者自主呼吸，防止呼吸肌萎縮。

1.2.2對照組 給予纖維地塞米松灌洗支氣管肺泡(規格5 mg/1 mL，國藥準字H44025148，三才石岐制藥股份有限公司生產)治療，步驟為：(1)術前30 min給予15 mg地西泮(規格10 mg/2 mL，國藥準字H14022662，山西振東安特生物制藥有限公司)靜脈注射，將2%鹽酸利多卡因注射液噴灑咽喉(規格0.1 mg/5 mL，國藥準字H61023138，陜西健民制藥有限公司)行局部麻醉；(2)患者仰臥體位，將ABF-3型纖維支氣管鏡(上海澳華光電內窺鏡有限公司產品)經氣管導管進入氣道，逐級觀察總氣管、左右支氣管及肺葉段支氣管；(3)待氣管內痰液清洗干凈后，給予地塞米松20 mg+0.45%氯化鈉溶液60 mL灌洗，20 mL/次，連續3次。療程7 d。

1.2.3觀察組 在對照組治療的基礎上加用注射用烏司他丁(規格5萬單位/支，國藥準字H19990133，廣東天普生化醫藥股份有限公司)，劑量為10萬單位烏司他丁溶解于0.45%NaCl 20 mL中，靜脈推注，3次/d。，療程7 d。

1.3 觀察指標

1.3.1氧合指數、炎癥反應相關指標 分別于治療前后通過動脈血氣分析儀(型號NOVA pHOx plus)監測2組患者血氧分壓、計算氧合指數(氧合指數=血氧分壓/吸入氧濃度)；同時采集清晨空腹外周靜脈血2 mL，3 500 r/mim離心10 min分離血清，采用免疫吸附(ELISA)法檢測血清中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM1)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant factor-1,MCP-1)及白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)水平，試劑盒均購自于貝克曼庫爾特商貿中國有限公司。

1.3.2氧化應激指標 取1.3.1項下的血清，采用放射免疫沉淀法檢測血清中缺血修飾清蛋白(ischemia modified albumin,IMA)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPAR γ)及丙二醛(malondialdehyde ,MDA)水平，試劑盒均購自于貝克曼庫爾特商貿中國有限公司。

1.3.3TGF-β1/Smads信號通路相關因子 分別于治療前后采集患者外周空腹靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，加入紅細胞裂解液(美國Pharmacia公司生產)200 μL，振蕩混勻，室溫避光5 min，3 500 r/mim離心10 min分離，收集上清液細胞裂解液 ，用BCA試劑盒(碧云天生物技術公司生產)檢測樣本蛋白濃度；SDA-PAGE垂直電泳分離，轉移至預冷的轉膜液中，200～250 mA恒流轉膜2 h，上樣量為30 μg/孔；洗滌液沖洗，10%脫脂奶粉(TTBS配制)4 ℃封閉過夜；分別加入TGF-β1 Ⅰ型受體(tgf-beta 1,TGF-β1RⅠ)、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3單克隆抗體(抗體稀釋液為5%脫脂奶粉)室溫孵育4 h；用TTBS洗滌后滴加生物素標記的二抗室溫孵育1 h、TTBS洗滌、顯色，實驗設GAPDH為內參照。應用Image J軟件計算目標條帶的灰度值，目標蛋白含量以目標蛋白/GAPDH比值來表示。

1.3.4疾病嚴重程度 由1位5年以上臨床工作經驗的呼吸內科醫師采用雙盲法完成疾病嚴重程度的判斷，使用急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation， APACHEⅡ)評分、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)評分及LIS評分評估病情。

1.3.5治療期間指標及臨床結局 記錄2組患者治療期間臨床結局，包括機械通氣時間、ICU時間、住院時間、ARDS發生率、呼吸機相關肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)發生率及總死亡率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料

結果顯示，2組患者性別、年齡、發病時間及損傷原因等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 血清氧合指數、炎癥反應相關指標

治療前，2組ALI患者血清氧合指數、NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清氧合指數較治療前明顯提高，血清NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 兩組ALI患者一般資料比較Tab.1 Comparison of the general data between the two groups

表2 治療前后2組ALI患者血清氧合指數、炎癥反應相關指標比較Tab.2 The serum oxygenation index and inflammatory response related indexes were compared between the two groups before and after

2.3 血清氧化應激相關指標

治療前，2組ALI患者血清IMA、ROS、PPAR γ、MDA水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清PPAR γ較治療前明顯提高，血清IMA、ROS、PPAR γ、MDA水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 治療前后2組ALI患者血清氧化應激相關指標比較Tab.3 Comparison of serum oxidative stress related indexes between the two groups before and after

2.4 血細胞TGF-β1/Smads信號通路相關因子

治療前，2組ALI患者血細胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者血細胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 治療前后2組ALI患者血細胞TGF-β1/Smads信號通路相關因子表達水平Tab.4 Relative expression levels of TGF-β1/Smads signaling pathway related factors in blood cells of patients between the two groups before and after

2.5 APACHEⅡ、SIRS、LIS評分

治療前，2組ALI患者APACHEⅡ、SIRS、LIS評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者APACHEⅡ、SIRS、LIS評分均較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

表5 治療前后2組ALI患者APACHEⅡ、SIRS及LIS評分分]Tab.5 APACHEⅡ, SIRS, and LIS scores before and after treatment between the two

2.6 治療期間指標及臨床結局

結果顯示，治療期間觀察組ALI患者機械通氣時間、ICU時間、住院時間、ARDS發生率、VAP發生率均較對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05)；2組患者總死亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 兩組ALI患者治療期間指標及臨床結局比較Tab.6 Comparison of clinical outcomes between the

3 討論

ALI作為一種過度反應的急性炎癥疾病，往往受到多種內、外源因素的影響，患者病情進展較快，再加之老年群體多存在組織器官功能減退、合并癥較多等現象，更易危及生命[8]，因此，對ALI患者進行針對性治療并優化其臨床結局顯得尤為重要。長期臨床實踐證實，支氣管肺泡灌洗聯合局部注藥在諸多肺部疾病治療中發揮著重要效應，其主要優點在于可直視肺內病灶并局部給藥，可深達支氣管以下肺段及亞肺段水平，能有效清除阻塞支氣管的炎性分泌物和痰液，進一步改善氣道阻塞并促進肺組織通氣[9]。地塞米松是臨床最常用的糖皮質激素，能夠發揮促進痰液排出、阻滯單核細胞及粒細胞活化等功能，被認為是治療急危重癥患者的良藥，而纖支鏡下肺內應用地塞米松可提高局部藥物濃度，且藥物直達肺部患處病變組織，可進一步提升治療效果[10]。烏司他丁是一種分子質量為67 kDa的蛋白酶抑制劑，可抑制多種水解酶活性、抑制炎癥介質釋放等；近年來其在心、肝、肺、腎等重要臟器的保護治療中扮演著重要角色，本研究結果顯示，地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合靜脈推注烏司他丁較單一用藥在整體治療效果方面更具有優勢，能夠明顯加快患者呼吸系統功能的恢復進程并優化其臨床結局，考慮可能是烏司他丁可通過臟器保護作用及信號通路調節等多條路徑來促進臨床療效的提高，但仍需進一步驗證。

肺纖維化是ALI發展進程中主要的病理進程，而現階段有大量研究表明TGF-β1參與肺纖維化的發生、發展，其作為一類強細胞外基質沉積促進劑，可直接影響細胞生長、分化、凋亡及遷移等一系列改變，被認為是多種組織發生纖維化的“總開關”[12-13]。TGF-β1異構體基本在所有的細胞內均存在，且其在肺固有細胞、肺間質細胞及浸潤炎性細胞等均有分泌，過度表達的TGF-β1可誘導正常成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，亦可促進蛋白酶的表達，繼而誘導細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中多種成分發生水解。生成的肌成纖維細胞也會產生TGF-β1，對負反饋系統造成影響，進一步加速肺部纖維化進程。另外，TGF-β1還能使其他促纖維化因子上調而誘導細胞增殖和凋亡，以實現上皮間質轉化過程[14]。Smad家族是TGF-β1的下游底物，在TGF-β1與細胞膜表面受體結合進行跨膜轉導過程中，TGF-β1RⅠ和TGF-β1RⅡ形成受體異聚體，促進Smad2/3蛋白磷酸化并進行細胞內轉導信號，完成信號跨膜轉導，進一步加速巨噬細胞等炎性細胞的滲出和向損傷病灶的移動，進而促進上皮-間質轉化過程[15]。因此，本研究通過分析治療前后患者外周血TGF-β1/Smads信號通路相關因子水平變化，旨在為評價預后提供一線依據。結果顯示，觀察組經治療后的外周血TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平明顯高于對照組，提示烏司他丁對ALI病程中的肺間質纖維化具有顯著的抑制作用，這也是其阻止患者病情進展的直觀證據。

目前的研究認為除了肺部實質損傷外，在ALI的進展過程中，炎癥細胞浸潤增強進而導致肺結構的破壞及肺部的病理性改變，故炎癥反應程度也可間接反映ALI患者疾病嚴重程度[16-17]。IL-8能夠介導炎癥細胞的激活和浸潤，在組織損傷后引起的炎性反應及應激反應中顯著升高，引起呼吸道痙攣、液體滲出等，進一步抑制了呼吸功能[18]。MCP-1為對單核細胞具有特異性趨化和激活活性的細胞因子，可與單核-巨噬細胞表面受體結合，趨化單核細胞進入肺組織，繼而造成肺泡腔內聚集并形成肺泡炎癥[19]。VCAM1是100～110 kDa 的I型跨膜蛋白，能夠介導炎癥細胞與內皮細胞的黏附并促進炎癥反應的放大。NF-κB是在炎癥反應激活過程中發揮關鍵作用的轉錄因子，其既可維持機體內環境的穩定，又可介導病原特異性應答，而肺泡、毛細血管的大量破壞可使NF-κB與其抑制分子IκB解離并成為游離且結合形成無活性的三聚體，保證炎癥反應處于持續激活的狀態[20]。既往研究發現，炎癥反應的激活會進一步引起局部組織中氧自由基過度生成，再加之ALI這一強烈的應激源對氧化應激反應的刺激作用，大量自由基會在病程中大量分泌[21]。IMA屬有氧代謝產物，其含量聚集則能夠引起組織氧化損傷，故IMA為反映機體應激性損傷的敏感性指標[22]。PPAR γ是核激素受體家族中的配體激活受體，能夠在氧化應激過程中發揮抗氧化作用，一項基礎實驗證實，LPS誘導的RAW 264.7細胞急性氧化損傷模型中，PPAR γ通路會促進自噬和抑制氧化應激反應來緩解細胞損傷[23]。ROS為氧的正常代謝的天然副產物，當人體處于創傷時，會造成呼吸鏈缺損及解偶聯過程能量轉換下降，促進ROS的過量釋放，而過量的ROS又可與組織局部的脂質成分發生氧化反應，引起MDA大量生成，形成惡性循環[24]。本研究結果顯示，觀察組患者經治療后的血清NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8以及IMA、ROS、MAD均明顯低于對照組，而PPAR γ則反之，提示地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合靜脈推注烏司他丁能夠進一步抑制炎癥反應及氧化應激的激活。分析原因可能為烏司他丁可抑制中性粒細胞蛋白酶釋放，阻斷NF-κB等炎癥信號通路，以控制炎性介質過度分泌，同時烏司他丁亦能夠有效改善微循環和肺組織灌注，進一步清除自由基，這也是臨床需加強抗炎癥、增強抗氧化能力時，優先選擇聯合用藥的又一依據。經臨床觀察發現，在ALI患者整個病理生理過程中呼吸氧合功能存在異常，主要原因為患者胸腔壓力增大，下腔靜脈受到壓迫，引起回流障礙，導致血流動力學異常，進而造成氧合功能異常。本研究結果顯示，觀察組治療后氧合指數顯著高于對照組，提示地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合靜脈推注烏司他丁能夠明顯改善ALI患者的氧合功能。其作用機制可能與該治療方案能降低患者肺毛細血管通透性、抑制血肺泡灌洗液炎性反應有關。

綜上所述，地塞米松灌洗支氣管肺泡聯合靜脈推注烏司他丁對老年ALI的治療效果優于單一地塞米松灌洗支氣管肺泡，可顯著加速病情恢復進程，并改善氧合功能和臨床結局，其機制可能與減輕機體全身炎癥反應、氧化應激反應并抑制TGF-β1/Smads信號通路的活化有關。但由于本研究僅進行了短期觀察，加之未對相關指標進行動態觀察，數據結果的代表性有一定局限，因此尚有待更長期的大樣本動態研究加以證實。