槲皮素通過PI3K/Akt/mTOR通路促進缺血性腦卒中小鼠康復的機制

李秋菊， 江毅， 趙仁超， 莊緒娟

(山東第一醫科大學附屬青島醫院 & 青島市城陽區人民醫院 神經內科， 山東 青島 266109)

缺血性腦卒中是因多種因素作用而導致的局部腦組織缺血缺氧性壞死，進而造成神經功能缺失，具有較高的臨床致殘率和致死率[1]。目前臨床對于缺血性腦卒中患者的治療主要為溶栓、血管介入及抗血小板聚集等綜合性治療，雖然能夠在一定程度上改善腦梗死患者梗死灶部位的血液供應，但即使再通血管后，腦組織因缺血-再灌注而導致的損傷也會對患者遠期腦功能恢復產生明顯的不良影響[2]。目前缺血性腦卒中的主要發病人群為18～50歲、且發病率逐年升高，導致社會主要勞動力損失，社會負擔增大[3]。因此積極探究缺血性腦卒中發生的分子機制，并采集有效治療措施，對促進患者腦功能恢復，降低臨床致殘率和致死率有十分重要的意義。槲皮素為具有抗氧化特性的天然膳食黃酮，既往研究中發現其能夠緩解炎癥反應和氧化應激反應，減輕組織水腫，緩解臟器損傷[4]。楊青麗等[5]發現槲皮素可保護缺氧缺血性腦損傷神經元細胞；黃超等[6]指出槲皮素具有拮抗炎癥反應和降低氧化應激反應的效果，能夠對神經細胞凋亡途徑進行抑制，可改善創傷性腦損傷患者的臨床療效；磷脂酰肌醇-3(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(acid，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路為經典生物信號通路，曾有學者通過激活該信號通路，提高了膿毒癥小鼠急性肺損傷的內源性保護機制[7]，因此本文分析槲皮素通過PI3K/Akt/mTOR通路促進缺血性卒中小鼠康復的效果，以期能為缺血性腦卒中的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 50只SPF級C57BL/6小鼠，均為雄性，6～8周，體質量為20～25 g、平均(22.19±1.32) g，均由成都醫學院實驗動物中心購入，動物許可證號SCXK(川)2021-003。實驗前7 d所有小鼠均進行適應性喂養，設置光照12 h/d，濕度為40%～55%，室內溫度21～22 ℃，自由進食進水。

1.1.2主要儀器 電子顯微鏡(EM ACE900型，德國Leica公司)、蛋白電泳儀(1659001型，美國Bio-Rad公司)、手動輪轉式切片機(RM2125RTS型，德國Leica公司)、酶標儀(Fax-20100型，美國INStat公司)凝膠成像儀(GIS-500型，杭州米歐儀器有限公司)。

1.1.3主要試劑 槲皮素(上海源葉生物科技有限公司)、NVP-BEZ235(美國BioVision)、酶聯免疫吸附試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)、β-actin鼠抗和十二烷基硫酸鈉(美國Sigma公司)、蛋白提取試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)、RIPA裂解液(上海碧云天公司)、PI3K、Akt、mTOR、磷酸化(phosphoric，p-)-PI3K、p-AKT、p-mTOR鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗(美國Abcam公司)。

1.2 研究方法

1.2.1分組、給藥及線栓法建模 50只小鼠隨機分為對照組、模型組、槲皮素組、通路抑制組及聯合組，每組10只；參考文獻[8]，槲皮素組每日灌胃200 mg/kg槲皮素，通路抑制組每日灌胃60 mg/kg NVP-BEZ235，聯合組每日灌胃200 mg/kg槲皮素和60 mg/kg NVP-BEZ235，模型組和對照組每日灌胃等體積生理鹽水，均給藥7 d；50只小鼠均術前禁食6 h，按照0.3 g/kg體質量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將小鼠以仰臥位固定，消毒后切開頸前正中，模型組、槲皮素組、通路抑制組及聯合組參考文獻[9]復制大鼠腦缺血再灌注損傷模型。對照組小鼠術前禁食6 h，按照0.3 g/kg體質量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，將小鼠以仰臥位固定，消毒后切開頸前正中，不對血管做任何操作。

1.2.2學習記憶能力Morris水迷宮實驗測評 (1)定位航行實驗：將大鼠面向池壁由不同象限放入小鼠，開展Morris水迷宮實驗，使小鼠尋找第1象限水平面下1 cm的平臺，其所消耗的時間為逃逸潛伏期，設置最大限時為120 s，超出者計為120 s，每只小鼠每日訓練4次，共5 d，取平均值為學習成績。(2)空間探索實驗：Morris水迷宮實驗最后1 d，拆除平臺，將與平臺正對的象限作為小鼠入水點，并自由游泳120 s，記錄該時間內各小鼠穿過平臺的次數和在目標象限內停留的時間，以此衡量記憶能力。

1.2.3腦功能缺陷評分 依據Vemuganti等[10]的方法對小鼠腦功能缺陷程度進行5分制評估，1分為提尾左前肢屈曲，2分為行走向左側轉圈，3分為向左側傾斜，4分為無法自發行走、意識減退，5分為缺血相關死亡。

1.2.4腦梗死灶體積 給藥7 d后，麻醉狀態下采用斷頭法處死小鼠，快速取出腦組織，制作厚度為1.5 mm的冠狀切片，將其置于2%氯化三苯基四氮唑內37 ℃孵育15 min，染色后使用掃描儀對腦片進行掃描，并使用Image pro plus軟件分析腦片內梗死體積。

1.2.5炎性因子和氧化應激因子 取小鼠海馬組織0.5 g，低溫融化后加入9倍體積預冷的PBS勻漿，13 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯免疫吸附法檢測白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。

1.2.6PI3K/ Akt/ mTOR蛋白及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平 采用Western blot法檢測，取海馬組織0.5 g，制備細胞懸液，以12 000 r/min離心10 min，取沉淀加入RIPA裂解液，重懸細胞，置于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，加入Loading Buffer緩沖液200 μL，置于100 ℃水浴內煮沸10 min，采用BCA法測量蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳提取總蛋白，將蛋白移至PVDF膜后放入TBST溶液內洗膜5 min，加一抗(1 ∶1 000)，4 ℃恒溫箱內孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗(1 ∶2 000)，封閉，曝光，以β-actin為內參，分析灰度值，獲得蛋白表達水平，每組均重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 學習記憶能力

與對照組比較，其余各組小鼠的穿越原平臺次數、目標象限停留時間百分比均減少，逃逸潛伏期均延長，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠穿越原平臺次數及目標象限停留時間百分比減少、逃逸潛伏期延長，槲皮素組小鼠穿越原平臺次數及目標象限停留時間百分比增加、逃逸潛伏期縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠學習記憶能力比較Tab.1 Comparison of learning and memory ability in each group

2.2 腦功能缺陷評分和腦梗死灶體積

與對照組比較，其余各組小鼠腦功能缺陷評分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠腦功能缺陷評分和腦梗死灶體積均升高、槲皮素組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦功能缺陷評分和腦梗死灶體積比較Tab.2 Comparison of brain function deficit scores and cerebral infarction volumes in each group

2.3 海馬組織炎性因子水平

與對照組相比，其余各組小鼠海馬組織IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織IL-6、TNF-α水平均升高，槲皮素組降低，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 海馬組織氧化應激因子水平

與對照組比較，其余各組小鼠海馬組織的MDA水平升高、SOD水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，通路抑制組小鼠海馬組織的MDA水平升高，SOD水平降低，槲皮素組則相反，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組小鼠海馬組織炎性因子水平比較Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the hippocampus in each group

表4 各組小鼠海馬組織氧化應激因子水平比較Tab.4 Comparison of oxidative stress factor levels in the hippocampus in each group

2.5 海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達水平

與對照組比較，其余各組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達水平降低，槲皮素組升高，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1和表5。

圖1 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達灰度值Fig.1 The protein expression levels of PI3K, AKT, and mTOR in mouse hippocampus in each group

表5 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達水平比較Tab.5 Comparison of the protein expression levels of PI3K, AKT and mTOR in mouse hippocampus among the following groups

2.6 海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平

與對照組比較，其余各組小鼠海馬組織的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平降低，槲皮素組則相反，差異有統計學意義(P<0.05)。聯合組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表6。

圖2 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平灰度值Fig.2 The protein phosphorylation levels of PI3K, AKT, and mTOR in mouse hippocampus in each group

3 討論

缺血性腦卒中是僅次于缺血性心臟病的第2大人口死亡因素，患者發病后隨病情進展表現出炎癥反應、氧化應激反應，進而損傷腦組織，造成視聽覺消失、癱瘓、癡呆等行為，因此臨床中常將感覺、

表6 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平比較Tab.6 Comparison of PI3K, AKT, and mTOR protein phosphorylation levels in mouse hippocampus in each group

運動、認知等神經功能異常行為作為了解缺血性腦卒中患者腦損傷程度的監測指標，通過給予血液恢復、溶栓等治療措施改善預后[11-12]。槲皮素近年來因其可抵抗腦缺血再灌注損傷而得到關注，因此本文就此展開相關研究。

本文結果顯示，各組小鼠的學習記憶能力和腦功能與對照組比較均降低，其中PI3K/Akt/mTOR通路抑制組小鼠的學習記憶能力和腦功能最差，提示抑制PI3K/Akt/mTOR通路會對小鼠學習記憶能力和腦功能產生明顯不良影響，而槲皮素組小鼠學習記憶能力和腦功能則優于模型組、通路抑制組和聯合組，且腦梗死灶體積較各組明顯縮小，提示給予缺血性腦卒中小鼠槲皮素能夠縮小腦梗死體積，保護小鼠學習記憶功能和腦功能。進一步探究中發現，PI3K/Akt/mTOR通路抑制組小鼠的IL-6和TNF-α水平最高，提示抑制該通路會造成缺血性腦卒中小鼠機體炎性反應加重，而槲皮素組小鼠海馬組織的IL-6和TNF-α水平明顯低于模型組、通路抑制組和聯合組，提示槲皮素可在一定程度上緩解炎性反應。同樣監測海馬組織內MDA和SOD水平，可以發現槲皮素也能夠緩解氧化應激反應，是由于槲皮素能夠清除多余的活性氧，可通過激活線粒體自噬而發揮保護腦神經和腦功能的作用，同時槲皮素還能夠抗血栓、抑制炎癥反應和細胞凋亡，緩解腦卒中后的繼發性損傷，降低神經元受損程度[13-15]。既往在部分學者對缺血性損傷動物模型的研究中也發現[16-20]，槲皮素能夠提高內源性抗氧化酶CU/Zn/錳超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶在海馬CA1椎體神經元中的表達，具有較強的神經保護功能，可有效緩解腦缺血。同時本文結果顯示，槲皮素組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達水平和p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平升高，而通路抑制組小鼠的各蛋白表達及磷酸化表達水平均降低，提示槲皮素可能通過上調PI3K/Akt/mTOR通路而發揮腦功能保護作用，該通路通過逐級磷酸化下游蛋白，能夠對機體多種細胞生物學過程進行調控，如可通過調控細胞自噬而緩解缺血性卒中造成的炎性反應和腦損傷[21-25]。

綜上所述，槲皮素可通過上調PI3K/Akt/mTOR通路改善缺血性卒中小鼠的學習記憶能力，提升腦功能，緩解腦部炎性反應和氧化應激反應，從而促進缺血性卒中小鼠康復。