右美托咪定通過AMPK/mTOR通路對老年大鼠術后認知功能障礙的影響

張倩， 張志卓， 王歡， 李瑞冰

(1.河北省邢臺市第三醫院 麻醉科， 河北 邢臺 054000; 2.河北省邢臺市第三醫院 手術室， 河北 邢臺 054000; 3.河北省邢臺市第三醫院 心外科， 河北 邢臺 054000)

術后認知功能障礙(post-operative cognitive dysfunction，POCD)是指在麻醉手術后患者中樞神經系統出現的一種并發癥[1]，多發于老年患者，主要表現為認知、注意力、意識及抽象思維等方面的障礙[2-3]。對POCD發病原因目前尚無統一觀點，在一些國內外研究中認為手術麻醉因素會誘導中樞神經細胞結構發生改變，進而引發神經系統紊亂，導致神經細胞的凋亡與炎癥，是引發POCD的重要原因[4-5]。目前臨床尚未明確治療POCD的方法，因此尋找安全有效的治療藥物是臨床亟需的。右美托咪定作為選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，具有良好的鎮靜、鎮痛及抗交感作用[6-7]。腺苷酸活化蛋白激酶和絲氨酸/雷帕霉素靶蛋白[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin, AMPK/mTOR]信號通路是一組在細胞營養與能量代謝、細胞生長和細胞內環境穩態中發揮作用的重要調控途徑[8]，在多項研究中表現出與神經細胞的凋亡有一定的作用[9-10]。為了探究右美托咪定對POCD 的改善作用及其相關機制，本研究通過對老年大鼠進行肝部分切除術并進行一系列分子生物學實驗，以期為POCD的臨床治療及藥物研發提供一定的思路及參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑與藥物 鹽酸右美托咪定注射液(國藥準字H20090248，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，β-肌動蛋白(β-actin)、AMPK、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin , mTOR)、線粒體促凋亡蛋白(BCL2 Associated X, BAX)與胱天蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)抗體及鼠抗二抗(北京博奧森生物技術有限公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(德國Roche公司，批號11782418713)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.1.2實驗動物 選取SPF級健康SD大鼠60只，由江蘇艾菱菲生物科技有限公司提供，均為16～20月齡老年雄性大鼠，體質量為(550±50)g，大鼠隨機分為假手術組、模型組、右美托咪定低劑量組及右美托咪定高劑量組，每組15只；采用標準飼料與飲用水喂養，飼養溫度保持在(25±2)℃，相對濕度保持在(40±2)%，動物房進行定期消毒和通風，適應性飼養7 d進行實驗。

1.2 研究方法

1.2.1術后認知障礙模型大鼠的制備 正常適應性喂養7 d，所有大鼠均以2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠均在左側最后1根肋骨下3 cm處打開1個切口，沿皮膚組織逐層分離，暴露出游離肝臟左葉，將肝左葉切除，確認無出血后縫合等待大鼠蘇醒，完成老年大鼠術后認知功能障礙模型的制備[11]。假手術組麻醉后僅打開腹腔，不予以肝臟部分切除，其余步驟與另外3組一致。

1.2.2給藥 低劑量組術前30 min以20 μg/kg鹽酸右美托咪定腹腔注射給藥，高劑量組以40 μg/kg鹽酸右美托咪定腹腔注射給藥，模型組與假手術組大鼠每天相同時間點腹腔注射等量生理鹽水。術后模型組、高劑量組死亡各2只，剔除；右美托咪定低劑量組死亡1只，剔除；最終每組選取10只動物進行后續實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1Zea-Longa評分大鼠認知障礙情況 采用 Zea-Longa 評分法于術前及術后1、6、12、24、72 h時對大鼠神經功能進行評分，無神經功能缺損癥狀為0分、無法充分伸展前爪為1分、行走時出現偏癱轉圈狀況為2 分、行走時出現向左側傾斜狀況為3分、完全無法自發行走并出現意識喪失為4分，得分越高神經功能障礙越嚴重。術前各組大鼠Zea-Longa評分為0，待Zea-Longa評分處死大鼠，并取其海馬組織備用，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2免疫印跡試驗(Western blot)檢測AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3蛋白表達水平 取出部分大鼠海馬組織，通過組織破碎儀加入RIPA 裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，變性后放入-20 ℃冰箱備用。以Western Blot法分別通過電泳、轉膜后進行相關抗體孵育，包括AMPK、mTOR與凋亡相關蛋白BAX、Caspase-3等抗體孵育，孵育完成洗膜后，用辣根過氧化物酶標記的鼠抗二抗孵育，最后將含有蛋白標記的膜洗凈，涂上化學發光顯影液通過顯影儀拍照，結果用ImageJ軟件對灰度值進行系統性分析。

1.3.3實時熒光定量試驗(Real-time PCR)檢測AMPK/mTOR通路相關mRNA水平 取出部分大鼠海馬組織，將大鼠海馬組織于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機進行勻漿處理，隨后進行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。取制備的RNA進行反轉錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3上下游引物混合離心(引物序列見表1)，隨后于PCR儀上進行擴增，循環完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值(Ct值)進行相對定量分析，比較各組心海馬組織AMPK/mTOR通路相關mRNA的表達水平。

表1 所選基因引物序列Tab.1 Primer sequences of selected genes

1.3.4海馬組織TUNEL染色病理學觀察 將各組大鼠海馬組織包埋后進行切片、脫蠟至脫水，隨后浸潤在H2O2中孵育30～40 min以消除其中的內源性過氧化酶活性；之后按照TUNEL染色試劑盒說明書步驟處理樣本、并染色，隨后在400倍顯微鏡下觀察各組樣本中海馬CA1區神經元染色情況，陽性結果為出現細胞核固縮且細胞核被染成近褐棕色。

1.3.5ELISA檢測海馬組織炎癥水平 取出部分大鼠海馬組織，以25 mL/g 加入生理鹽水混合研磨勻漿，離心后轉移上清液至干凈的EP管，按照ELISA試劑盒步驟對樣本IL-1β與TNF-α進行標記，通過酶標儀測量450 nm處的吸光度，并以標準曲線來計算其中IL-1β與TNF-α含量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 Zea-Longa認知障礙評分

術后各時間點各組大鼠的Zea-Longa認知障礙評分結果顯示，模型組、低劑量組與高劑量組大鼠神經功能缺損評分顯著高于假手術組，低劑量組與高劑量組大鼠神經功能缺損評分顯著低于模型組，差異有統計學意義 (P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Zea-Longa認知障礙評分情況Tab.2 Zea-Longa cognitive impairment scores of rats in each

2.2 海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3蛋白表達

術后低劑量組與高劑量組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3的蛋白水平相對高于假手術組，但明顯低于模型組，同時高劑量組較低劑量組AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3的蛋白水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與假手術組比較， P<0.05；(2)與模型組比較， P<0.05；(3)與低劑量組比較， P<0.05。圖1 各組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的蛋白水平Fig.1 Protein level of AMPK, mTOR, BAX， and Caspase-3 in the hippocampus of rats in each group

2.3 海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的mRNA水平

低劑量組與高劑量組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3 mRNA水平相對高于假手術組，但明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 神經元細胞病理學形態

結果如圖3所示，模型組大鼠海馬CA1區神經元細胞排列紊亂，細胞核出現固縮狀態，右美托咪定組大鼠海馬CA1區神經元數量與模型組相比明顯增加，神經元凋亡指數明顯降低，大鼠海馬CA1區部分神經細胞結構恢復正常，細胞膜基本完整、且高劑量組凋亡情況低于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：(1)與假手術組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與低劑量組比較，P<0.05。圖2 各組海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的mRNA水平Fig.2 Levels of AMPK, mTOR, BAX, and Caspase-3 mRNA in the hippocampus of rats in each group

注：(1)與假手術組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與低劑量組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠海馬組織神經元細胞病理學形態(TUNEL染色，×400)Fig.3 Pathological morphology of neuronal cells in the hippocampal tissues of each group(TUNEL staining, ×400)

2.5 IL-1β、TNF-α水平

ELISA結果顯示術后各組大鼠海馬組織勻漿中L-1β與TNF-α水平均顯著升高，但與模型組相比右美托咪定能一定程度上減輕炎癥水平、且高劑量組降低IL-1β與TNF-α水平較低劑量組更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織勻漿中IL-1β與TNF-α水平Tab.3 Levels of IL-1β and TNF-α in the hippocampal

3 討論

術后認知功能障礙的發生機制目前尚不明確，目前認為是多重因素共同作用的結果[12]。在神經退行性疾病中，神經細胞的凋亡往往發揮著重要作用，它通過基因表達調控從而導致細胞自主并且程序性的死亡[13]，如果神經細胞凋亡水平的平衡失調，則會導致神經退行性疾病的發生發展，如阿爾茲海默癥[14]、帕金森病[15]、亨廷頓氏舞蹈癥[16]等存在認知功能障礙的疾病。本研究通過肝部分切除術進行老年大鼠術后認知功能障礙模型的制備和相應的實驗研究發現，模型組大鼠較模型建造前Zea-Longa認知功能障礙評分明顯升高，大鼠出現不同程度的行走偏癱、傾斜或意識喪失，提示術后認知功能障礙大鼠模型制備成功。同時本研究實驗結果還顯示，右美托咪定組大鼠海馬組織神經細胞凋亡率雖略高于假手術組，但明顯低于模型組，該結果表明右美托咪定能有效抑制海馬區神經細胞的凋亡，從而產生直接的神經保護作用。陳燕樺等[17]與康文越等[18]研究結果顯示右美托咪定通過拮抗神經細胞的凋亡發揮一定的神經保護作用，與本研究結果一致。另有研究表明，在術后認知障礙大鼠中其海馬區AMPK/mTOR信號通道表達異常[19]。AMPK是一種進化上保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶[20]，mTOR也是一個保守的絲/蘇氨酸激酶，是細胞生長和增殖的中樞控制器[21]。在目前的研究中，AMPK/mTOR信號通路是細胞能量代謝、內環境穩態和細胞凋亡進程中重要調控途徑[22]，在多種神經退行性疾病中發揮著重要作用。在本研究中，模型組大鼠海馬區AMPK、mTOR蛋白與凋亡相關蛋白BAX、Caspase-3的表達明顯上升，同時mRNA水平檢測結果與蛋白表達檢測結果一致，提示其凋亡水平增加，這可能與手術應激條件下AMPK被激活導致出現代謝衰竭狀態后誘導產生大量的活性氧促使大鼠海馬神經細胞凋亡有關，其下游mTOR同樣會參與級聯反應導致的神經細胞凋亡[23]。當給予鹽酸右美托咪定后，術后認知障礙模型大鼠海馬組織AMPK與mTOR表達量顯著降低，神經細胞凋亡程度同樣減輕，提示右美托咪定或許通過抑制AMPK/mTOR信號通路發揮作用，且提高給藥濃度后，其抑制AMPK與mTOR的蛋白表達水平與抑凋亡作用明顯提升，進一步說明了右美托咪定能通過抑制AMPK/mTOR信號通路發揮抑凋亡作用。

此外，在一些研究中由于手術應激反應導致的腦內炎癥的發生，從而出現一系列中樞神經系統退行性變化，具有神經毒性的炎癥介質，會影響神經元功能，從而導致認知功能的減退[24]。在本研究結果中，術后各組海馬組織IL-1β與TNF-α水平升高，與其他研究一致。與模型組相比，右美托咪定能一定程度上減輕炎癥水平，且高劑量組降低IL-1β與TNF-α水平較低劑量組更高，這可能與右美托咪定的中樞性擬交感作用和激活膽堿能抗炎通路從而發揮抗炎作用有關，國外的一些研究同樣證實右美托咪定具有一定的抗炎作用[25]。

綜上所述，本研究通過建立術后認知障礙老年大鼠模型，應用右美托咪定治療發現右美托咪定改善其海馬區神經細胞的凋亡進程，減輕手術應激產生的海馬區炎癥反應，從而發揮改善老年大鼠海馬組織損傷后的認知功能障礙情況，其機制可能與調控凋亡相關信號通路AMPK/mTOR有關。本研究為開展老年患者手術應激產生的認知障礙的預防與治療提供了新的思路與研究證據。