GPR97、HuR和Sema3A蛋白在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達(dá)

王勃， 陳瑞花， 王昆， 李志強(qiáng)， 魏琴， 姜濤, 張春**

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué) 新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830011)

細(xì)粒棘球蚴病是一種因感染細(xì)粒棘球蚴絳蟲蟲卵所致的慢性人獸共患寄生性傳染病，可對(duì)人的肝臟、肺以及其他器官造成嚴(yán)重傷害[1]。細(xì)粒棘球蚴蟲隨血液循環(huán)遷移至中間宿主的肝、肺和其他臟器中，出現(xiàn)原發(fā)囊性病變，其中在肝臟中最為常見[2]。細(xì)粒棘球蚴蟲早期定植引起機(jī)體急性炎癥反應(yīng)而被清除，殘留的幼蟲待包囊形成，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[3]，影響免疫細(xì)胞和細(xì)胞趨化因子功能，可逃避宿主的免疫反應(yīng)[4]。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的受體超家族，位于細(xì)胞膜表面，參與介導(dǎo)生物過程與多種疾病[5]。G蛋白偶聯(lián)受體97(G protien-coupled recepter 97，GPR97)具有經(jīng)典的黏附GPCR結(jié)構(gòu)，具有7個(gè)跨膜螺旋、1個(gè)N端片段和1個(gè)C端片段，通過與下游G蛋白相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-7]。在免疫細(xì)胞中，GPR97在白細(xì)胞中表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[8]，GPR97有可能與炎癥相關(guān)，但GPR97對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制仍然不清楚。GPR97基因敲除的腎臟保護(hù)作用是通過腦信號(hào)蛋白3A(semaphorin 3A，Sema3A)信號(hào)通路進(jìn)行的，同時(shí)在體外基因沉默GPR97可減輕低氧細(xì)胞模型引起的腎小管上皮的凋亡和促炎因子的產(chǎn)生，加入Sema3A重組蛋白可逆轉(zhuǎn)這一作用，而GPR97對(duì)Sema3A的表達(dá)調(diào)控是通過人抗原R(human antigen R，HuR)蛋白進(jìn)行的。HuR蛋白在肝臟多種疾病中均扮演著重要的角色[9]，如在肝炎中，HuR可以促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)[10]、還可調(diào)控巨噬細(xì)胞的活性[11]。目前，關(guān)于GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達(dá)情況還未見報(bào)道。因此，本研究通過建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型，采用免疫組織化學(xué)法觀察GPR97、Sema3A和HuR蛋白在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡述這3種蛋白與細(xì)粒棘球蚴病的相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)粒棘球蚴原頭蚴 選擇6～8周齡雌性C57BL/6小鼠12只，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)環(huán)境[SYXK(新)2018-0002]。購(gòu)買當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)感染細(xì)粒棘球蚴病的羊肝臟，抽取病灶組織囊液，收集原頭蚴。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗GPR97、Sema3A、HuR多克隆抗體(Affinity公司，美國(guó))，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒、蘇木精和伊紅染液、天狼星紅染液、磷酸鹽緩沖液PBS(北京索萊寶科技有限公司)。試驗(yàn)儀器主要有石蠟切片機(jī)(Leika公司，德國(guó))和生物顯微鏡(Motic實(shí)業(yè)有限公司，廈門)等。

1.2 研究方法

1.2.1建立細(xì)粒棘球蚴感染肝臟模型 檢測(cè)原頭蚴活力并計(jì)數(shù)，通過小鼠肝門靜脈注射細(xì)粒棘球蚴500個(gè)，建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟模型。

1.2.2采集、處理肝臟標(biāo)本 感染細(xì)粒棘球蚴2周和8周的小鼠經(jīng)二氧化碳安樂處死，采集肝臟組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋，制備肝臟石蠟切片。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)和天狼星紅染色 肝臟石蠟切片置于60 ℃恒溫箱中烘烤30 min后，經(jīng)脫蠟、二甲苯、梯度乙醇復(fù)水，用于進(jìn)行蘇木素-伊紅染色和苦味酸-天狼星紅染色，再梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色 經(jīng)梯度乙醇復(fù)水后的肝臟石蠟切片，依次進(jìn)行檸檬酸鹽溶液微波中火加熱15 min，3%過氧化氫處理15 min，加封閉液室溫孵育1 h，PBS洗3次；加GPR97、Sema3A、HuR一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，加DAB顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察GPR97、Sema3A、HuR蛋白表達(dá)情況，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5張切片，每張片子隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)包囊放大視野(200×)，在Motic生物顯微鏡下拍照、記錄，進(jìn)行蛋白表達(dá)染色評(píng)分。染色評(píng)分由染色強(qiáng)度與程度的乘積確定，染色強(qiáng)度按照不著色為陰性(0分)、著淺黃色為弱陽(yáng)性(1分)、著中黃色或著棕色且無(wú)背景著色或者著深棕色但有淺棕色背景為中等陽(yáng)性(2分)、細(xì)胞著深棕色或棕褐色且無(wú)背景著色為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)，染色程度陽(yáng)性細(xì)胞的頻率<5%為0分(-)、5%～25%為1分(+)、26%～50為2分(++)、51%～75%為3分(+++)、>75%為4分，包囊相關(guān)陽(yáng)性細(xì)胞的頻率為占包囊的整體細(xì)胞。綜合評(píng)分分為0～1分為陰性(-)、2～4分為弱陽(yáng)性(+)、5～8分為中度陽(yáng)性(++)、9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝組織細(xì)胞學(xué)

HE染色和苦味酸-天狼星紅結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴感染第2周時(shí)小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整、肝索排列整齊，偶見纖維細(xì)胞大量增生、肉芽腫形成，炎性細(xì)胞增多，將炎癥組織放大觀察可見纖維化包囊逐漸成型；感染第8周時(shí)小鼠肝組織結(jié)構(gòu)不完整，肝索排列紊亂，部分肝細(xì)胞被破壞、有炎性病灶，包囊出現(xiàn)空泡化，外囊外膜層纖維化組織增生且致密。見圖1、圖2。

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖1 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織感染第2周和第8周時(shí)小鼠肝組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

注：A、C為第2周肝組織，B、D為第8周肝組織。圖2 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織第2周和第8周時(shí)苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果Fig.2 Picric acid-Sirius red staining of liver tissues in mice with echinococcus granulosus infection in 2nd and 8th week

2.2 肝組織GPR97蛋白表達(dá)

GPR97蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時(shí)，小鼠肝組織初步形成的包囊內(nèi)部分呈黃褐色陽(yáng)性著色，肝細(xì)胞胞質(zhì)有不同程度的黃色著色；第8周時(shí)，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃褐色陽(yáng)性著色，外囊層無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；與感染第2周時(shí)比較，感染第8周時(shí)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的GPR97蛋白表達(dá)免疫評(píng)分均升高(P<0.05)。見圖3。

2.3 肝組織HuR蛋白表達(dá)

HuR蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時(shí)，小鼠肝組織形成的包囊內(nèi)基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，偶見褐色陽(yáng)性著色，肝胞質(zhì)呈黃色陽(yáng)性；第8周時(shí)，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃色或黃褐色陽(yáng)性著色，外膜層無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，周邊肝細(xì)胞胞質(zhì)為黃色陽(yáng)性；與感染第2周時(shí)比較，感染第8周時(shí)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的HuR蛋白表達(dá)免疫評(píng)分均升高(P<0.05)。見圖4。

注：A、C為第2周肝組織GPR97蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織GPR97蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時(shí)比較，P<0.05。圖3 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織的GPR97蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of GPR97 protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

注：A、C為第2周肝組織HuR蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織HuR蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時(shí)比較，P<0.05。圖4 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織的HuR蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of HuR protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

2.4 肝組織Sema3A蛋白表達(dá)

Sema3A蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，第2周時(shí)，小鼠肝組織包囊內(nèi)有黃褐色陽(yáng)性著色，肝細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的黃色陽(yáng)性；第8周時(shí)，包囊空泡化后生發(fā)層細(xì)胞呈黃色陽(yáng)性，外膜層無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，周邊肝細(xì)胞質(zhì)呈黃色陽(yáng)性著色；與感染第2周時(shí)比較，感染第8周時(shí)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞、外囊外膜層細(xì)胞、周圍肝組織細(xì)胞的Sema3A蛋白表達(dá)免疫評(píng)分均升高(P<0.05)。見圖5。

注：A、C為第2周肝組織Sema3A蛋白免疫組化，B、D為第8周肝組織Sema3A蛋白免疫組化。(1)與感染肝臟第2周時(shí)比較，P<0.05。圖5 細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝組織Sema3A的蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Sema3A protein in liver tissues of mice with echinococcus granulosus infection

3 討論

細(xì)粒棘球蚴病是由細(xì)粒棘球絳蟲引起的一種人畜共患疾病，其在人體中通常保持無(wú)癥狀，直到包囊破裂或不斷生長(zhǎng)變大，足以對(duì)周圍組織施加壓力，產(chǎn)生類似于占位性腫塊的癥狀[12]。本研究建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型，HE染色和天狼星紅染色結(jié)果表明，感染第2周時(shí)炎性細(xì)胞明顯增多、纖維化包囊逐漸形成，纖維化組織逐步增生且致密；第8周時(shí)，包囊空泡化，形成內(nèi)囊和外囊結(jié)構(gòu)。包蟲囊內(nèi)側(cè)的生發(fā)層向囊腔內(nèi)產(chǎn)生育囊，外側(cè)為無(wú)細(xì)胞角質(zhì)層，具有彈性、機(jī)械抗性和過濾器的作用，保護(hù)生發(fā)層不被宿主細(xì)胞接觸。寄生蟲的生存策略不僅依賴于謀劃物理屏障，還依賴于下調(diào)宿主反應(yīng)。囊外側(cè)被宿主炎癥細(xì)胞以及不同數(shù)量的纖維組織包圍[13]，常見情況還有包蟲立即被未過濾的膠原層包圍，而在寄生蟲較遠(yuǎn)的地方發(fā)現(xiàn)一些炎癥灶[14]。在免疫細(xì)胞中，GPR97在白細(xì)胞中表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞[8]，GPR97最初發(fā)現(xiàn)于小鼠腸淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)B細(xì)胞命運(yùn)和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移中起重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型中，GPR97在初形成的包囊中有弱陽(yáng)性表達(dá)。感染初期炎性細(xì)胞增多，局部炎癥的維持與寄生蟲活力低下有關(guān)，而炎癥的消退與幼蟲的繁衍有關(guān)[13]。GPCRs位于細(xì)胞表面可以調(diào)控多種生理功能，但是關(guān)于GPR97在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的作用仍存在爭(zhēng)議。在高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖型小鼠體內(nèi)，GPR97基因敲除可減輕脂肪組織炎癥，減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，增加M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致促炎因子表達(dá)降低，抑炎因子表達(dá)升高[16]，但在卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘的小鼠體內(nèi)，GPR97基因敲除對(duì)炎癥因子產(chǎn)生沒有影響[17]。本研究結(jié)果表明，隨著包囊空泡化的形成，內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞中GPR97呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，炎性病灶增多，可能參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

HuR作為一類RNA結(jié)合蛋白，參與炎癥和免疫反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明，糖尿病患者心臟HuR表達(dá)升高與炎癥標(biāo)志物水平增高相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示在細(xì)粒棘球蚴感染初期，包囊內(nèi)基本無(wú)HuR陽(yáng)性表達(dá)，待包囊空泡化后，HuR在內(nèi)囊生發(fā)層細(xì)胞呈中等陽(yáng)性，與GPR97陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)相近。Wei Fang等[19]發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷模型小鼠腎臟HuR表達(dá)上調(diào)且與GPR97表達(dá)量呈正相關(guān)，并且GPR97通過影響HuR蛋白表達(dá)可對(duì)Sema3A進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，從而影響Sema3A蛋白表達(dá)。Sema家族參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，Sema3A與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞凋亡，而炎癥因子會(huì)下調(diào)Sema3A受體，阻止Sema3A誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球蚴感染初期時(shí)，Sema3A在形成的纖維化包囊中心細(xì)胞為弱陽(yáng)性表達(dá)，在空泡化包囊生發(fā)層細(xì)胞也為弱陽(yáng)性表達(dá)，提示炎性病灶增多可能會(huì)影響Sema3A蛋白表達(dá)。

綜上所述，GPR97、HuR和Sema3A在細(xì)粒棘球蚴感染小鼠第2周和第8周肝臟空泡化包囊中均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，可能參與感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)，是否為膜蛋白GPR97影響RNA結(jié)合蛋白HuR參與Sema3A信號(hào)通路調(diào)控，需進(jìn)一步研究。