不同病理分級IgA腎病患者腎小球足細胞自噬體數目分析

洪琴， 王婭， 粟鳳， 甘昌玉， 達靜靜， 胡建軍**

(1.貴州省人民醫院 病理科， 貴州 貴陽 550001； 2.貴州省人民醫院 腎內科， 貴州 貴陽 550001)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)1968年被Berger和Hinglais首次描述和命名，其特點是腎小球系膜區有IgA或以IgA為主的免疫復合物沉積，免疫復合物由聚合IgA1(a IgA1)和補體3(C3)組成，亦還有可變的IgG和/或IgM共沉積[1]。IgAN是全球最常見的腎小球腎炎，是慢性腎病和終末期腎功能衰竭(ESRD)的重要原因，嚴重危害人類健康[2]。IgAN發病機制尚不清楚，認為是多種機制作用的結果，提出“四重打擊學說”：第一重打擊，lgAN患者循環中存在高水平的半乳糖缺失的IgA1(Gd-IgA1)；第二重打擊，Gd-IgA1作為自身抗原誘發自身抗體的產生(抗糖抗體)；第三重打擊，抗糖抗體和半乳糖缺失的IgA1二者形成循環免疫復合物在腎臟沉積；第四重打擊，通過激活補體、誘發炎癥因子等途徑致腎組織損傷，導致IgA腎病的發病和進展。目前認為IgA1分子的糖基化異常造成IgA1易于自身聚集或被IgG或IgA識別形成“致病性”免疫復合物，可能是IgA腎病發病中的始動因素[3]。新近研究提示，足細胞自噬異常是IgAN發生發展過程中的重要機制[4]。自噬是由溶酶體介導的蛋白質和細胞器的降解過程，這個過程涉及清除衰老的細胞器和破壞性蛋白質，同時維持細胞內環境的穩定性[5]。自噬參與了人類多種疾病的發病機制，越來越多證據表明，自噬參與了腎臟疾病的發病機制[4]。足細胞是構成腎小球濾過屏障的重要細胞，位于腎小球毛細血管簇的表面，自噬與足細胞結構及功能的穩定密切相關，自噬功能的紊亂將導致足細胞的嚴重損傷，是導致IgAN蛋白尿發生、發展以及ESRD的重要原因及關鍵因素[6]。在糖尿病患者和大鼠的研究中發現，自噬不足伴有足細胞丟失的大量蛋白尿，在小鼠蛋白尿的進展中具有因果關系[7]。此外，早期研究發現IgAN兒童患者足細胞存在兩種自噬類型(Ⅰ型、Ⅱ型)，Ⅰ型自噬(直徑約1 μm)表現為致密的核糖體區域和少量的脂滴，其限制膜起源于線粒體；Ⅱ型自噬(直徑3～8 μm)表現為一個濃縮的核糖體和許多脂滴，其限制膜起源于粗面內質網；Ⅱ型自噬轉變為自噬體和自噬泡，提示Ⅱ型自噬在清除蛋白質和脂質方面比Ⅰ型自噬更重要，以Ⅰ型自噬為主的IgAN患者的病理損害程度更嚴重，預后較差[8-9]。研究顯示，IgAN成人患者足細胞中自噬體的數量較少，表明自噬參與足細胞損傷及IgAN的進展[10]。本研究通過比較IgAN患者及腎結石患者足細胞自噬體數目的差異，同時觀察不同病理分級IgAN患者自噬體數目的變化，探究IgAN發展過程中足細胞自噬的作用。

1 資料與方法

1. 1 一般資料

收集2017—2020年有完整臨床資料并確診為原發性IgAN患者的腎組織石蠟標本，分為IgAN1組(2017—2019年206例)和IgAN2組(2018—2020年30例)，選擇2020年腎結石患者石蠟標本3例作為對照組。IgAN1組和IgAN2組的患者腎臟穿刺標本腎小球≥6個，電鏡標本腎小球≥1個。

1.2 方法及觀察指標

1.2.1血清肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白 收集IgAN1組血清肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量數據，分析組內不同性別患者3項指標的差異。

1.2.2腎臟組織學 對照組及IgAN1組、IgAN2組腎臟組織石蠟包埋標本均進行切片，蘇木精-伊紅(HE)染色及六氨銀(PASM)染色，光鏡下觀察腎小球系膜區的增生情況、有無節段性硬化或球形硬化、有無新月體及腎小管萎縮。

1.2.3腎臟病理學分級及分組 由兩位經驗豐富的病理醫師對IgAN1組、IgAN2組進行Haas病理分級，分為IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級組、IgAN2組Hass Ⅰ～Ⅴ級組。參考文獻[11]對腎活檢組織進行病理學分級：Ⅰ級，輕微病變型，僅見腎小球系膜區的輕微的系膜細胞增生、無節段性或球性硬化、無新月體；Ⅱ級，局灶節段性腎小球硬化樣型，與原發性局灶節段性腎小球硬化癥(FSGS)相似，無新月體；Ⅲ級，局灶增生型，不足50%的腎小球出現細胞增生，增生的細胞可以只限于系膜細胞，也可伴有內皮細胞增生、主要以節段性分布為主，可以有少數新月體；Ⅳ級，彌漫增生型，超過50%的腎小球出現細胞增生，增生的細胞常為系膜細胞中度以上的增生，也可伴有內皮細胞增生、多數彌漫性增生、部分節段性增生，可以有新月體；V級，進行性慢性腎炎型，≥40%的腎小球呈現球性硬化，腎皮質約40%的腎小管萎縮或消失。

1.2.4腎小球補體C3c及IgA免疫熒光沉積 免疫熒光顯微鏡觀察對照組及IgAN1組、IgAN2組HassⅠ-Ⅴ級組腎小球補體C3c及IgA免疫熒光沉積。免疫熒光顯示強度分為：“-”表示高、低倍鏡均不顯示沉淀，“±”表示高倍鏡隱約顯示沉積，“1+”表示低倍鏡隱約可見沉積、高倍鏡下可見沉積，“2+”表示低倍鏡下可見顯示沉積，高倍鏡下清晰顯示沉積，“3+”表示低倍鏡下清晰沉積、高倍鏡下耀眼沉積，“4+”表示低倍鏡下耀眼沉積、高倍鏡下刺眼的沉積。

1.2.5足細胞中自噬體 采用透射電鏡觀察對照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組足細胞胞質內的自噬體。電鏡下自噬體是由單層膜或雙層膜包裹的圓球形的結構，每組每個病例隨機選取20個足細胞計數自噬體數量，每個足細胞取1～2個視野，計數每個足細胞內自噬體的平均數量，分析對照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組各組間自噬體數量的變化趨勢，分析自噬體數量變化與病理分期的關系

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 IgAN1組各臨床指標的差異及其性別特點

IgAN1組不同性別患者的血肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量比較，男性患者血肌酐更高，尿蛋白及24 h尿蛋白更多，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示男性臨床表現更嚴重，腎功能不全表現更顯著；見表1。IgAN1組Hass分級：Hass Ⅰ級67例，Hass Ⅱ級59例，Hass Ⅲ級31例，Hass Ⅳ級14例，Hass Ⅴ級35例；與HassⅤ級比較，HassⅠ級組患者尿蛋白及24 h尿蛋白定量增加，血肌酐降低(P<0.05)；見表2。

表1 IgAN1組不同性別患者尿蛋白及血肌酐比較Tab.1Comparison of urine protein and serum creatinine in IgAN1 patients between males and

2.2 腎臟組織學觀察

光鏡下觀察，對照組腎小球系膜區未見增寬，IgAN1組和IgAN2組腎小球系膜區增寬、系膜基質和系膜細胞不同程度增生，可見節段性硬化及新月體形成，伴腎小管萎縮、腎間質纖維組織增生、慢性炎細胞浸潤。

表2 不同病理分級IgAN1組患者尿蛋白及血肌酐比較Tab.2 Comparison of urine protein and serum creatinine in IgAN1 group between different pathological

2.3 腎臟病理學分級

HassⅠ級組腎小球系膜區輕度增寬，系膜基質及細胞輕度增生；HassⅡ級組可見節段性硬化；HassⅢ級組局灶系膜基質及細胞節段性中度加重伴內皮細胞增生，可見節段性硬化，可見新月體形成；HassⅣ級組系膜基質及細胞中度彌漫性增生，局灶節段性重度加重伴內皮細胞增生，可見節段性硬化及球性硬化，可見新月體形成；HassⅤ級組可見≥40%腎小球球性硬化，伴腎小管萎縮、腎間質纖維組織增生、慢性炎細胞浸潤。提示Hass分級越高，腎小球病變越重、越多樣。見圖1。

2.4 免疫熒光沉積

對照組腎小球未見IgA及C3c的免疫熒光反應，IgAN1組、IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組腎小球均可見IgA、C3c在系膜區呈較強的團塊狀綠色熒光沉積(≥2+)。見圖2。

注：光鏡下觀察腎小球系膜區有無增寬、系膜基質和系膜細胞有無增生、有無節段性硬化及新月體形成、伴/不伴腎小管萎縮、腎間質纖維組織增生以及慢性炎細胞浸潤情況。圖1 各組腎臟組織HE及PASM染色(HE，×400； PASM，×400)Fig.1 HE staining and PASM staining of renal tissues in each group (HE,×400; PASM,×400)

2.5 腎小球內自噬體

電鏡下觀察對照組及IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組腎小球的超微結構，均可見足細胞胞質內的自噬體。與正常對照組比較，IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組患者的自噬體數量減少, 隨著IgAN2組Hass病理分級的進展，自噬體數量隨著病理級別增加而增多(P<0.01)。見圖3和表3。

注：熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區有無IgA、C3c熒光沉積。圖2 各組腎小球免疫熒光C3c、IgA沉積(IF，×400)Fig.2 Immunofluorescent staining results showing glomerular C3c and IgA deposits in each group (IF,×400)

注：箭頭所示為自噬體。圖3 IgAN2組患者足細胞胞質內自噬體(透射電鏡，×20 000)Fig.3 Autophagosomes in podocyte cytoplasm in IgAN2 group (TEM,×20 000)

表3 各組腎小球足細胞自噬體數量比較Tab.3 Comparison of autophagosome numbers in glomerular podocytes between

3 討論

IgAN是腎小球基底膜中IgA型免疫球蛋白沉積引起的腎小球腎炎的常見形式之一，其臨床表現和進展率取決于臨床病理表型和隨訪時間，其發病機制尚不清楚，目前研究發現其發病為多打擊機制的結果[12-13]。現有研究發現，IgAN中足細胞損傷是導致蛋白尿發生、發展的重要原因之一，目前研究其損傷機制包括補體系統激活、細胞因子改變、足細胞裂孔隔膜蛋白(nephrin)蛋白異常、異常糖基化IgA1等，而足細胞自噬在上述損傷機制中起重要作用[14]。IgAN是我國最常見的腎小球腎炎，是導致終末期腎功能衰竭的病因之一，約30%的IgAN患者在確診后10 ～20年進展為腎功能衰竭[15]。因此研究IgAN的發病機制，探討并研制新的治療方案改善患者病情十分重要。

自噬是一種在真核細胞中高度保守的、用于降解和回收利用細胞長效生物大分子和受損細胞器的過程[16]，目前已知足細胞病變、IgA腎病、糖尿病腎病等多種腎臟疾病的發生發展與自噬密切相關[6-10]。研究發現，足細胞特異性缺失自噬相關因子Vps34的小鼠在9周后出現早期蛋白尿、進行性腎小球硬化和腎功能衰竭[17]；腎臟缺血再灌注損傷的研究中發現，自噬相關基因(Atg)5基因缺陷型足細胞不能進行正常自噬，其氧化和泛素化蛋白的積累以及足細胞內質網應激最終導致蛋白尿增加和腎小球硬化[18]；在用a IgA1刺激的腎小球系膜細胞中，有學者發現SUMO1可能通過抑制自噬來促進其細胞增殖[19]；隨著系膜細胞增殖，IgAN血清中TGF-β1升高，TGF-β1抑制足細胞自噬并激活mTOR通路，即IgAN進展時，TGF-β1可以激活mTORC1并抑制自噬，進一步了解系膜細胞增殖導致足細胞功能障礙的機制[20]。新近研究發現[21]在FSGS患者的足細胞中自噬空泡數量減少，可以通過雷帕霉素誘導自噬來減少足細胞的損傷，同時，3-甲基腺嘌呤抑制自噬使大鼠對氨基核苷誘發的FSGS變得敏感，而雷帕霉素部分保護足細胞免受氨基核苷誘導的腎病的影響。

目前研究發現足細胞自噬功能異常將導致足細胞的嚴重損傷，是導致IgAN蛋白尿發生、發展的重要原因，本研究根據收集年限將有完整臨床資料并確診為原發性IgAN患者的腎組織石蠟標本分為2017—2019年IgAN1組(206例)，根據Haas病理分級分為IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級組，比較IgAN1組Hass Ⅰ～Ⅴ級組各組間患者尿蛋白定量、24h尿蛋白定量及血肌酐的差異及其性別特點，由于所在科室2018年起開展電鏡檢測，故收集2018—2020年IgAN2組(30例)，選擇2020年腎結石患者石蠟標本3例作為對照組，根據Haas病理分級分為IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組，電鏡下觀察自噬體并計數，觀察時需要與其他細胞器相鑒別，如調亡小體，表現為由胞膜包繞的細胞碎片，包有胞質成分及核碎片，胞質中的細胞器出現變性改變，可被周圍的細胞吞噬，比較IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組自噬體數量與對照組的改變，分析自噬體數量變化與病理分期的關系。統計結果發現IgAN1組不同性別兩組患者在血肌酐、尿蛋白及24 h尿蛋白定量方面比較，差異明顯(P<0.05)，且男性患者血肌酐更高；IgAN1組HassⅠ級組患者尿蛋白定量及24 h尿蛋白定量較IgAN1組HassⅤ級患者更高，而IgAN1組HassⅤ級組患者血肌酐更高，提示IgAN1組HassⅤ級組患者腎功能減退更明顯；IgAN2組HassⅠ～Ⅴ級組患者較對照組自噬體數量下降(P<0.001), 且隨著Hass病理分級的進展，自噬體數量隨著病理級別增加而增多(P<0.01)，提示IgAN患者足細胞自噬體數目隨病理分級的增高而增加，表明IgAN的發展過程中，足細胞自噬活性逐漸恢復，可能為組織自我清理過程增加，機體啟動自我保護和調節機制所致，由此可見足細胞自噬可能參與了IgAN的進程，但其具體機制有待進一步研究。

IgAN是我國最常見的腎小球腎炎，是導致終末期腎功能衰竭的病因之一，其臨床表現和進展率取決于臨床病理表型和隨訪時間，其發病機制尚不清楚，目前研究發現足細胞自噬異常在IgAN發生發展過程中起關鍵作用，本研究結果也揭示足細胞自噬與 IgA 腎病時的發生發展關系密切，提示自噬可能為IgA腎病治療的新靶點提供更多的思路。