鱉甲-莪術藥對對TGF-β1誘導的MDA-MB-231細胞侵襲轉移能力及其上皮間質轉化的作用及機制

朱久龍， 謝青， 黃雅珍， 朱曼荊， 駱小珊， 馮豆豆， 凌湘力， 謝甦***

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 中醫科，貴州 貴陽 550004；3.寧波市北侖區人民醫院 中醫科，浙江 寧波 315000)

乳腺癌是嚴重危害我國女性健康的惡性腫瘤，在全國女性惡性腫瘤中發病率排名第一，死亡率排名第五[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)表達均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌的20%，由于其高侵襲性、高復發率以及極易發生遠處轉移等特點，成為乳腺癌防治的重點和難點[2]。目前TNBC的重要研究方向是針對手術及放化療術后空窗期的有效藥物。藥對是中醫臨床遣藥組方的常用配伍形式，經過配伍的藥對可達到增強藥效、減輕毒副作用的目的。早在《神農本草經》中就有“藥有陰陽配合，子母兄弟”及“七情和合”等配伍理論記載。中藥藥對理論研究是現代中藥有效組分研究中的重要一步，在藥效物質和作用機理基本清楚的前提下，建立從有效方劑出發，在明確主靶點、強化主效應、降低副效應的基礎上，尋求高效可控的現代中藥，并建立以組分配伍研制現代中藥的新模式，是中藥現代化的重要研究方向[3]。基于此，有專家提出提出“養陰散結”理論[4-5]，臨床選用鱉甲-莪術君藥對組成中藥復方，扶正與祛邪共用，滋陰與散結并舉[6-7]，防治乳腺癌術后和(或)放化療后復發轉移[8]，使乳腺癌患者獲得較好的生存質量及較長的生存周期[5]。課題前期研究發現，以鱉甲-莪術為君藥對的甲術方能顯著抑制乳腺癌模型小鼠的腫瘤生長，且和環磷酰胺聯用能增強抗瘤作用，其可能機制與下調Wnt/β-Catenin信號通路中β-連環蛋白(β-catenin)、c-Myc以及G1/S-特異性周期蛋白-D1(cyclin D1)蛋白表達有關[9]。為探討鱉甲-莪術藥對能否通過Wnt/β-catenin信號通路影響乳腺癌上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而影響乳腺癌細胞侵襲轉移能力，本研究通過轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導TNBC細胞MDA-MB-231，模仿增強其侵襲轉移能力、促進其發生EMT進程的腫瘤生長環境，探究鱉甲-莪術藥對對含藥血清在抑制TGF-β1誘導的MDA-MB-231細胞侵襲轉移能力及其抗EMT進程中是否優于單藥使用，以及藥對配伍規律及深層機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞株 人源性三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株，購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2實驗動物 SPF級、6周齡、SD雌性、體質量(250±20)g的大鼠40只，購于長沙天勤生物科技有限公司，許可證號SCXK(湘)2019-0014。

1.1.3實驗藥品和試劑 鱉甲顆粒、莪術顆粒購自廣東一方制藥有限公司，紫杉醇購自美國MedChemExpress (MCE)公司(貨號HY-B0015/CS-1145)。DMEM高糖培養基(美國Gibco公司，C11995500BT)、胎牛血清(以色列BI公司，04-001-ACS)、二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司，D8370)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA，美國Gibco公司，25200-056)、青、鏈霉素雙抗(美國Hyclone公司，SV30010)、CCK8試劑盒(上海東仁化學科技有限公司，CK04)、高效RIPA裂解液組織/細胞(北京索萊寶科技有限公司，R0010)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，10494-1-AP)、抗波形蛋白(vimentin)抗體 (EPR3776，英國Abcam公司，ab92547)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，20874-1-AP)、兔抗Wnt 3a多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，bs-22503R)、N鈣黏蛋白(N-cadherin)兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，bs-22503R)、HRP標記山羊抗兔IgG二抗(武漢普美克生物公司，PMK-014-090)。

1.1.4實驗儀器 SW-CJ-2FD 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、Model 310恒溫CO2培養箱(美國Thermo公司)、CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、Allegra 64R Centrifuge 臺式高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)、多功能酶標儀(美國BioTek公司)、MinPROTEAN?Tetra電泳槽(美國BIO-RAD公司 )、MiniVE電泳儀(美國GE公司)、NanoDrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo公司)、ProFlexTM3 x 32孔逆轉錄PCR儀(美國Thermo公司)、ViiA7Dx熒光定量PCR儀(美國ABI公司 )、ChemiScope3000Mini化學發光成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1血清制備 40只SPF級雌性SD大鼠隨機分成空白組、鱉甲組、莪術組、鱉甲-莪術組，共4組，每組10只。根據“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”換算大鼠藥量：大鼠每日給藥劑量(g/kg)=成人每日用量(g/kg)×70(kg)×0.018(大鼠等效系數)/0.2(kg)×10?？瞻捉M予以蒸餾水灌胃10 mL/kg，每天2次，連續7 d；鱉甲組、莪術組、鱉甲-莪術組分別予以鱉甲(含生藥量6 g/kg)、莪術(含生藥量3 g/kg)、鱉甲-莪術藥對(含生藥量9 g/kg)灌胃10 mL/kg，每天2次，連續7 d。末次給藥前，禁食不禁水12 h；末次給藥后1.5 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用一次性真空采血管采取心臟全血，靜置、分離、過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.2.2細胞培養 將MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM混合培養基置于飽和濕度、5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱中培養，隔日換液，當細胞生長到80%時進行消化傳代，進行后續實驗。

1.2.3含藥血清分組 空白組，30%空白血清+DMEM高糖培養基；單誘導組，0.25%TGF-β1+30%空白血清+DMEM高糖培養基；鱉甲組，0.25%TGF-β1+30%鱉甲含藥血清+DMEM高糖培養基；莪術組，0.25%TGF-β1+30%莪術含藥血清+DMEM高糖培養基；鱉甲-莪術組，0.25%TGF-β1+30%鱉甲-莪術含藥血清+DMEM高糖培養基；紫杉醇組，0.25%TGF-β1+30%空白血清+DMEM高糖培養基+紫杉醇(IC50濃度為890 nmol/L)。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 將細胞以5× 103個/孔的密度接種于96孔培養板中，每組4個復孔。待24 h細胞貼壁后棄培養基，分別用各組含藥血清培養基培養96 h，在相應時間點向96孔板中每孔加入CCK-8溶液10 μL和DMEM培養基90 μL，培養箱中孵育1 h后，采用多功能酶標儀在37 ℃、波長450 nm處測定各組吸光度(OD)值，細胞抑制率=(對照組-實驗組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將密度為1×106個/mL的細胞均勻鋪板于6孔板內，待24 h細胞貼壁后棄培養基，用200 μL滅菌槍頭劃線，PBS緩沖液洗凈劃線上的殘存細胞后加入各組含藥血清培養基，使用電子顯微鏡分別于0、12及24 h拍照并觀察細胞遷移能力的變化。

1.2.6Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 -80 ℃冰箱取出保存的基質膠，液化后與DMEM培養基按照1 ∶6比例稀釋，于每個Transwell板上室加入50 μL，放入培養箱孵育4 h，待膠成為固態。按“1.2.4”方案干預細胞96 h后消化細胞并計數，用DMEM培養基配置成密度為1×104個/mL的細胞懸液，每個上室均勻加入200 μL，下室加入含10%胎牛血清的培養基800 μL/孔，于37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h。取出Transwell板，PBS緩沖液涮洗、晾干，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，PBS緩沖液再次涮洗、晾干，棉球擦去小室表面細胞和結晶紫，100倍倒置顯微鏡下觀察各組細胞穿過小室情況，每孔隨機取5個視野，統計細胞數目，計算平均值。

1.2.7Western blot法檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Wnt3a、β-catenin蛋白表達 按上述“1.2.4”方案干預細胞96 h后收集細胞，冰上裂解30 min，超聲破碎儀破碎，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將各組蛋白濃度調整為30 g/L，加入Loading Buffer ，100 ℃、10 min煮沸變性。10% SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應一抗(稀釋比1 ∶10 000至1 ∶800) 4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，ECL化學發光法曝光，條帶保存，Image J軟件分析條帶灰度值，計算目標蛋白表達量。

1.2.8RT-qPCR檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Wnt3a及β-catenin mRNA表達 按上述“1.2.4”方案干預細胞96 h后收集細胞，Trizol法提取細胞總RNA，Nano-drop 2000c測定各組總RNA純度和濃度，逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件為：25 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min。以cDNA為模板，使用Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行加樣，樣品在Applied Biosystems7500中進行RT-qPCR反應，引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成，引物序列見表1。反應程序：95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，循環40次；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。記錄各組Ct值，mRNA以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3 統計學分析

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果

2.1 TGF-β1誘導MDA-MB-231細胞EMT水平上調

細胞增殖抑制率結果表明，干預細胞24、48 h后，與空白組相比，單誘導組細胞增殖抑制率降低(P<0.05)。見圖1A。24 h細胞遷移率結果表明，與空白組相比，單誘導組細胞遷移率增加(P<0.05)，見圖1B。Transwell小室實驗表明，干預細胞48 h后，與空白組相比，單誘導組細胞遷徙數目增多(P<0.05)，提示細胞侵襲能力增強。見圖1C。Western blot實驗表明，與空白組相比，單誘導組細胞E-cadherin蛋白表達下降，Vimentin、 N-cadherin蛋白表達上升(P<0.05)。見圖1D-1E。綜上結果，提示TGF-β1可增強MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲能力，促進其EMT進程。

2.2 含藥血清對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

干預細胞96 h后，與單誘導組比較，各含藥血清組MDA-MB-231細胞的增殖抑制率均有不同程度的升高，表明各含藥血清組均能抑制細胞增殖(P<0.05)。組間比較，紫杉醇組對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率最高，鱉甲-莪術組對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率高于鱉甲組和莪術組(P<0.05)，見圖2。實驗表明，鱉甲-莪術藥對抑制 MDA-MB-231細胞增殖能力優于鱉甲、莪術單藥使用。

注：A為MDA-MB-231細胞增殖抑制率結果，B為MDA-MB-231細胞遷移率結果，C為MDA-MB-231細胞侵襲數目，D為E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表達，E為E-cadherin、Vimentin、N-cadherinm 蛋白表達統計結果；(1)與空白組比較，P<0.05。圖1 空白組與單誘導組MDA-MB-231細胞侵襲轉移能力Fig.1 Invasion and metastasis ability of MDA-MB-231 between blank group and single induction group

注：(1)與單誘導組比較，P<0.05；(2)與鱉甲-莪術組比較，P<0.05；(3)與紫杉醇組比較，P<0.05。圖2 含藥血清組對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率Fig.2 Proliferation inhibition rate of MDA-MB-231 cells in each experimental group

2.3 含藥血清對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

與單誘導組相比，干預細胞24 h后，各含藥血清組MDA-MB-231細胞遷移率均有不同程度的降低(P<0.05)，表明各含藥血清組均能抑制MDA-MB-231細胞遷移能力。組間比較，紫杉醇組MDA-MB-231細胞遷移率最低(P<0.05)，提示其抑制MDA-MB-231細胞遷移作用最佳；鱉甲-莪術組細胞遷移率低于鱉甲、莪術組(P<0.05)，表明鱉甲-莪術藥對對MDA-MB-231細胞遷移能力的抑制效果優于鱉甲、莪術單用。見圖3。實驗表明，鱉甲-莪術藥對抑制MDA-MB-231細胞遷移作用優于鱉甲、莪術單藥使用。

2.4 含藥血清對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響

與單誘導組相比，各含藥血清組的MDA-MB-231細胞遷徙數目均有不同程度的減少(P<0.05)，表明各含藥血清組均能抑制MDA-MB-231細胞侵襲能力。組間比較，紫杉醇組細胞遷徙數目最少(P<0.05)，提示其抑制細胞侵襲作用最佳；鱉甲-莪術組細胞遷徙數目少于鱉甲組、莪術組(P<0.05)，表明鱉甲-莪術藥對對細胞侵襲能力的抑制效果優于鱉甲、莪術單用。見圖4。實驗表明，鱉甲-莪術藥對抑制MDA-MB-231細胞侵襲作用優于鱉甲、莪術單藥使用。

注：A為劃痕實驗結果，B為各組細胞遷移率；(1)與單誘導組比較，P<0.05；(2)與鱉甲-莪術組比較，P<0.05；(3)與紫杉醇組比較，P<0.05。圖3 各含藥血清組對 MDA-MB-231細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of each experimental group on the migration ability of MDA-MB-231 cells

注：A為侵襲實驗結果，B為侵襲細胞數目；(1)與單誘導組比較，P<0.05；(2)與鱉甲-莪術組比較，P<0.05；(3)與紫杉醇組比較，P<0.05。圖4 各含藥血清組對 MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of each experimental group on the invasive ability of MDA-MB-231 cells

2.5 含藥血清對EMT相關蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表達的影響

Western blot實驗表明，與單誘導組比較，各含藥血清組均能上調E-cadherin蛋白表達，下調Vimentin、N-cadherin蛋白表達(P<0.05)。組間比較，鱉甲-莪術組E-cadherin蛋白表達最高；Vimentin、N-cadherin蛋白表達，紫杉醇組表達最低，鱉甲-莪術組表達低于鱉甲組、莪術組(P<0.05)。見圖5A、圖5C。

2.6 各含藥血清組對Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin蛋白表達的影響

Western blot實驗表明，與單誘導組比較，各含藥血清組均能下調Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平(P<0.05)。組間比較，紫杉醇組Wnt3a、β-catenin蛋白表達最低，鱉甲-莪術組Wnt3a、β-catenin蛋白表達低于鱉甲組、莪術組(P<0.05)。見圖5B、圖5D。

注：A為EMT相關蛋白圖，B為Wnt通路相關蛋白圖，C為EMT相關蛋白表達量，D為通路相關蛋白表達量；(1)與單誘導組比較，P<0.05；(2)與鱉甲-莪術組比較，P<0.05；(3)與紫杉醇組比較，P<0.05。圖5 含藥血清對MDA-MB-231細胞中EMT及Wnt通路中相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of drug containing serum on EMT and Wnt signaling pathway-related protein expression in MDA-MB-231 cells

2.7 含藥血清對EMT相關E-cadherin、Vimentin、N-cadherin mRNA表達的影響

RT-qPCR實驗表明，與單誘導組比較，各含藥血清組均能上調MDA-MB-231細胞中E-cadherin、下調Vimentin、N-cadherinmRNA表達水平(P<0.05)。組間比較，鱉甲-莪術組E-cadherinmRNA表達最高；Vimentin、N-cadherinmRNA表達方面，紫杉醇組最低，鱉甲-莪術組表達低于鱉甲組、莪術組(P<0.05)。見圖6A。

2.8 含藥血清對Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin mRNA表達的影響

RT-qPCR實驗表明，與單誘導組比較，各含藥血清均能下調MDA-MB-231細胞中Wnt3a、β-cateninmRNA表達水平(P<0.05)。組間比較，紫杉醇組Wnt3amRNA表達最低，鱉甲-莪術組β-cateninmRNA表達最低，鱉甲-莪術組表達低于鱉甲組、莪術組(P<0.05)。見圖6B。

注：A為EMT相關mRNA表達量，B為Wnt通路相關mRNA表達量；(1)與單誘導組比較，P<0.05；(2)與鱉甲-莪術組比較，P<0.05；(3)與紫杉醇組比較，P<0.05。圖6 含藥血清對MDA-MB-231細胞中EMT和Wnt通路中相關mRNA表達的影響Fig.6 Effect of drug containing serum on EMT and Wnt signaling pathway-related mRNA expression in MDA-MB-231 cells

3 討論

乳腺癌屬于中醫學“乳巖”“石巖”等范疇，古今醫家在治療上多有各自的心得和見解。有學者認為，在腫瘤發病上，正氣不足是關鍵因素，痰、瘀、濕、郁、熱毒是其病理基礎，女性乳腺癌亦是如此；乳腺癌病機實質是“陰中之陽”，“陽勝則陰病”，其亢烈之性必灼傷真陰，且“女子以肝為先天，以陰血為本”，術后女性病人正氣大傷，陰陽俱虛，加之放化療的不良反應，導致陰陽失衡，嚴重耗傷真陰；此時患者余邪未清，正氣亦無力鼓邪外出，痰、濕、瘀、熱、郁夾雜結聚，以致生活質量不佳，預后不良；基于真陰不足、瘀毒結聚的乳腺癌病機，提出了“養陰散結”的理論[10]。臨床中多選用以鱉甲-莪術為君藥對組方治療腫瘤[11]，鱉甲味甘、咸、性寒，入肝腎經，大補真陰，軟堅散結，滋陰潛陽，除骨蒸，退虛熱；莪術味辛、苦、性溫，入肝脾經，苦泄辛散溫通, 即入血分, 又入氣分, 能破血散瘀, 消癥化積, 行氣止痛。二者配伍，“陰陽雙消，滋陰起亟”[16]，既能滋陰潛陽，輔助正氣，又能增強軟堅散結, 破血化瘀消癥之力，消補結合，攻補兼施，達到扶正不留邪、祛邪不傷正的目的。

EMT是三陰性乳腺癌擴散轉移的重要途徑[12]。EMT是指上皮細胞失去黏附特性，從而獲得間質細胞特性，極性和細胞連接喪失，從而獲得運動和遷移能力[13]，使細胞從原發灶脫離并向基質浸潤，通過血道或淋巴道向遠處轉移的過程[14]。臨床通過對乳腺癌細胞和乳腺癌組織的分析，發現三陰性乳腺癌中普遍存在Vimentin、N-cadherin高表達，以及E-cadherin低表達[15]。研究表明，抑制EMT可有效降低TNBC復發轉移的風險[16]。TGF-β1可促進乳腺癌EMT進程[17]。在體內，TGF-β1可刺激上皮細胞的EMT，促進EMT的進展[18]。在腫瘤細胞生長早期，TGF-β1的主要作用是通過抑制細胞周期G1的進展來控制腫瘤細胞增殖[19],而當腫瘤細胞進入不可控生長階段時，會對這種抑制效應失去敏感性[20]，此外，這些腫瘤細胞開始分泌TGF-β1，并促進血管生成、增加腫瘤細胞穩定性，并創造出一個有利于腫瘤生長和轉移的微環境，提高腫瘤細胞的侵襲性[21]。研究表明，淋巴結轉移的乳腺癌患者TGF-β1表達水平明顯高于無淋巴結轉移者，在TGF-β1誘導條件培養基中培養的腫瘤細胞表現出更高的增殖和運動能力[22]。Wnt/β-catenin信號通路可介導乳腺癌發生EMT[23]。當Wnt信號激活通路后，β-catenin進入細胞核與轉錄因子形成轉錄復合物，引起下游靶基因的轉錄[24]。β-catenin向細胞核內聚集引起E-cadherin失去cadherin-catenin錨定連接而破壞E-cadherin/β-catenin復合體的穩定性[25]，E-cadherin失去黏附功能，導致細胞分散，移動力增加，獲得侵襲性間質表型，促進EMT進程[26]。研究表明，β-catenin與乳腺癌的侵襲遷移密切相關，侵襲型乳腺癌較非侵襲型相比β-catenin表達明顯增加，通過激活Wnt/β-catenin信號通路可降低E-cadherin表達[27]。因此，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活是影響EMT進程的重要途徑。

紫杉醇具有明確的細胞抑制作用，能夠阻滯細胞有絲分裂，并能通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路抗乳腺癌細胞侵襲轉移[28]。紫杉醇組作為陽性對照組，可增加實驗的科學性和可信度。選擇半數抑制濃度(IC50)作為干預濃度，是因為小劑量紫杉醇具有促進乳腺癌細胞增殖的作用[29]，而半數抑制濃度的抑制率就是50%，可以排除紫杉醇濃度干擾所致的實驗結果錯誤。本研究中，TGF-β1促進了MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲轉移能力及EMT進程。各含藥血清組均能抑制MDA-MB-231細胞的增殖、遷移及侵襲能力，上調E-cadherin，下調Vimentin、N-cadherin、Wnt3a、β-catenin蛋白及mRNA表達，且鱉甲-莪術藥對聯用具有增強藥效的作用，效果均優于鱉甲、莪術單藥使用。鱉甲-莪術藥對可能是通過下調Wnt3a、β-catenin，從而減少Wnt/β-catenin通路中關鍵的信號介質，進而影響乳腺癌細胞的EMT進程及其侵襲轉移能力。

綜上，根據中醫“養陰散結”理論，鱉甲-莪術藥對經過配伍后藥效增強，其效果優于單藥使用，其對TGF-β1誘導MDA-MB-231細胞侵襲轉移能力的抑制作用，可能機制為下調Wnt/β-catenin信號通路、抑制其EMT。