白細胞介素-4在小鼠急性肺損傷中的保護作用

趙琨， 肖云**， 肖茗耀， 楊純， 董敏娜， 向柄全

(1.昆明醫科大學第三附屬醫院 重癥醫學科， 云南 昆明 650118; 2.昆明醫科大學第一附屬醫院 急診醫學部， 云南 昆明 650032)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指感染、創傷等多種肺內外因素，直接或間接導致的以肺部炎癥和通透性增加為主要表現的臨床綜合征。ALI和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是連續的病理生理過程[1]。雖然近些年對于ALI的研究和治療取得了一定的進展，但其發生率仍然較高，且缺乏特異性的治療手段[2-3]。研究發現全身炎癥反應是各種病因導致ALI的共同途徑[4]，主要因為炎癥與抗炎反應的平衡被打破，導致肺部炎性損傷，因此糾正失衡的炎癥反應，可能是ALI治療的關鍵點[5]。細胞因子在介導和調節機體炎癥反應中扮演重要角色，常見促炎細胞因子有腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-6、IL-8、干擾素γ(inerferon γ，IFN-γ)等，抗炎細胞因子有IL-4、IL-10及IL-13等[6]。IL-4是機體重要的抗炎細胞因子之一，可通過抑制促炎細胞因子及炎癥介質的表達，誘導巨噬細胞向M2型轉化而發揮抗炎作用[7-8]。本研究前期發現，IL-4具有抑制炎癥反應、降低細胞凋亡的作用，在ALI中可能具有正向調節作用，本研究通過建立ALI小鼠模型，觀察IL-4對ALI小鼠的治療作用及機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

月齡7～8周的c57小鼠，體質量約20 g，IL-4細胞因子購自PeproTech，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自北京索萊寶公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自Beyotime，SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit及BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒均購自廣州Genecopoeia公司，Caspase-3抗體購自CST，Bcl-2 抗體購自GeneTex，Anti-beta Actin抗體購自Abcam，Immobilon Western HRP Substrate Luminol Reagent購自Affinity，小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒均購自NeoBioscience，小鼠IFN-γ ELISA試劑盒購自Abmart。

1.2 研究方法

1.2.1實驗分組 取雄性c57小鼠36只，隨機分為ALI組、 ALI+IL-4治療組和對照組，每組12只。ALI組和ALI+IL-4治療組小鼠腹腔注射LPS 10 μg/只[9]，建立小鼠ALI模型，對照組注射等體積的生理鹽水。ALI+IL-4治療組于30 min后腹腔注射IL-4 10 μg/kg[10]，此時，ALI組和對照組均腹腔注射等體積生理鹽水。3組小鼠均在完成注射后的12 h及24 h分別選取6只小鼠行眼球采血并頸椎脫臼法處死。

1.2.2細胞因子檢測 小鼠眼球采血0.5 mL、采集的血液離心后收集上清液，根據IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ不同細胞因子配制相應濃度梯度的標準液，將標準液及上述待測上清液加入相應的預包被 ELISA 試劑盒， 37 ℃孵育1 h，清洗后加入TMB底物，37 ℃放置30 min后加入停止液。使用酶標儀測定各孔450 nm波長處吸光度，根據標準液濃度及其OD450 nm繪制標準曲線，并測算小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ濃度。

1.2.3肺泡灌洗液蛋白含量測定 處死小鼠后，T字形剪開胸部皮膚，暴露胸腔，結扎氣管和右肺后，使用PBS 1 mL分3次對左肺進行肺泡灌洗，重復灌洗3遍，回收灌洗液離心吸取上清液測定體積并備用；重懸細胞沉淀進行細胞計數，若細胞數為109個/L，則認為灌洗液合格。配制0～1 g/L的梯度濃度蛋白標準液，并將待測的肺泡灌洗上清液及各濃度蛋白標準液加入96孔板中，最后按說明書加入BCA蛋白定量檢測試劑，37 ℃恒溫箱孵育30 min，測定各孔OD562 nm。根據蛋白標準液濃度及其OD562 nm繪制蛋白濃度標準曲線，計算肺泡灌洗液中的蛋白濃度，通過肺泡灌洗液蛋白濃度反映小鼠肺部炎性滲出程度、間接評估小鼠肺損傷程度。

1.2.4細胞凋亡相關基因及蛋白 處死小鼠后，取小鼠右肺下葉組織，檢測Caspase3、Bcl-2 基因mRNA及蛋白的表達。提取小鼠肺組織的總RNA，使用總RNA反轉錄得到cDNA，根據NCBI基因數據庫的轉錄組序列，合成Caspase3、Bcl-2以及內參GAPDH的引物，通過熒光實時定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測Caspase3及Bcl-2 mRNA相對表達量；提取小鼠肺組織總蛋白，總蛋白經過電泳、轉膜、膜封閉后，分別加入Caspase3、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃過夜孵育后加入二抗孵育，以ECL發光試劑成像，以β-actin為內參，對比各組Caspase3、Bcl-2蛋白的表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血清細胞因子檢測

與對照(Control)組比較，ALI組中IL-β分泌量雖然有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，而IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量均明顯增加，且差異具有統計學意義(P<0.05)，以上結果表明ALI會導致細胞因子分泌量增加，引發炎癥反應。而在ALI+IL-4組與ALI組的比較中，除IL-10在12 h時分泌量高于ALI組外(P<0.05)，ALI+IL-4組其余細胞因子的分泌量均低于ALI組(P<0.05)，以上結果表明，采用IL-4治療可以降低ALI小鼠中各類炎癥細胞因子的分泌量，減輕炎癥反應。見圖1。

注：圖A、B、D、E，(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05；圖C，(1)與24 h-Control組比較，P<0.05；(2)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(3)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖1 ELISA檢測小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10含量Fig.1 Concentrations of serum TNF- α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, and IL-10 by ELISA

2.2 肺泡灌洗液中蛋白含量

滲出液蛋白含量測定可作為評估肺泡-毛細血管屏障通透性的客觀指標。與對照(Control)組比較，ALI組中肺灌洗液中的蛋白濃度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，該結果表明ALI會增加肺泡-毛細血管屏障的通透性，加重肺部炎癥反應。而采用IL-4治療后，ALI小鼠肺灌洗液中蛋白濃度出現了下降，但差異也無統計學意義(P>0.05),結果表明IL-4治療后降低肺泡-毛細血管屏障的通透性，減輕肺部炎癥反應。見圖2。

圖2 BCA法檢測各組小鼠肺灌洗液中的蛋白含量Fig.2 Protein concentrations of mouse lung lavage fluids in each group by BCA

2.3 細胞凋亡相關基因及蛋白表達

對肺組織凋亡相關基因及蛋白的表達情況分析結果顯示，ALI組肺組織中Caspase3 mRNA和蛋白的表達量均升高，在24 h時差異具有統計學意義(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA和蛋白表達量在12 h和24 h時均出現了下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，以上結果表明ALI造成了肺組織細胞的損傷。而采用IL-4治療后，可以明顯降低ALI小鼠肺組織細胞中Caspase3 mRNA和蛋白的表達量(P<0.05)，增加Bcl-2 mRNA和蛋白表達量(P<0.05)，提示采用IL-4治療后肺組織的損傷情況得到顯著緩解。見圖3、圖4。

注：圖A，(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖B， (1)與24 h-Control組比較，P<0.05；(2)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(3)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖3 qPCR檢測小鼠肺組織中Caspase3、Bcl-2的表達Fig.3 The expression levels of Caspase3 and Bcl-2 in mouse lung tissues by qPCR

注：(1)與12 h-Control組比較，P<0.05；(2)與24 h-Control組比較，P<0.05；(3)與12 h-ALI組比較，P<0.05；(4)與24 h-ALI組比較，P<0.05。圖4 Western blot法檢測小鼠檢測小鼠肺組織中Caspase3、Bcl-2蛋白表達Fig.4 Protein expression levels of Caspase3 and Bcl-2 in mouse lung tissues by Western blot

3 討論

ALI是指感染、創傷等多種肺內外因素，直接或間接導致的以肺部炎癥和通透性增加為主要表現的臨床綜合征[11]；目前臨床治療措施主要為機械通氣及藥物治療等，有研究表明，采用保護性呼吸機策略能在一定程度上幫助ALI/ARDS患者的治療, 卻無法有效降低其死亡率[4]。目前臨床針對ALI仍缺乏特異性治療，發病率及死亡率仍較高。

ALI的發病機制錯綜復雜，至今仍未完全闡明。目前認為全身炎癥反應是各種病因導致ALI的共同途徑[12]。機體在感染和創傷等應激狀態下，多種炎性細胞、細胞因子釋放，引起廣泛性全身反應，同時反饋引起抗炎介質的釋放，從而達到制衡炎癥反應的目的。當二者之間的平衡被打破，則會導致全身炎癥反應[13-14]。肺臟的病理改變主要是微血管病變、肺泡通透性增加、大量炎癥細胞浸潤和炎癥介質的產生增加[15]。TNF-α直接損傷肺血管內皮細胞，同時可抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌肺泡表面活性物質。IL-1與TNF-α相似，同樣是ALI中另一個重要的炎癥介質；IL-6能夠促進巨噬細胞的分化及浸潤，同時上調黏附分子和其他細胞因子表達，從而加強炎癥反應[16]。

IL-4是機體重要的抗炎細胞因子之一，大量研究表明，IL-4可通過下調機體促炎細胞因子，促使機體促炎及抗炎細胞因子恢復平衡[17]。本研究結果顯示：與ALI組相比，ALI+IL-4治療組中各促炎細胞因子在造模后12 h及24 h均明顯下降，說明IL-4可通過下調促炎細胞因子水平來抑制肺部炎癥反應。同時有研究表明，在IL-4敲除的小鼠 ALI 模型中，其發病進展及炎癥反應遠高于IL-4正常的小鼠模型，這表明IL-4在ALI過程中扮演重要角色[18]。另一研究也得出同樣的結論，該研究通過移植分泌IL-4的巨噬細胞治療ALI，結果表明在移植后，小鼠肺部炎癥、組織損傷程度均明顯減輕，ALI小鼠死亡率明顯下降[19]。本研究結果表明：與ALI組相比，ALI+IL-4治療組中Caspase3表達顯著降低, Bcl-2的表達顯著升高，治療組小鼠死亡率明顯下降。

ALI/ARDS另一重要病理生理改變為炎癥反應導致肺泡-毛細血管通透性增高，富含蛋白的液體通過彌散機制向血管外和肺泡內移動，造成肺間質及肺泡水腫[20]。目前認為其機制主要為大量炎性細胞積聚于肺毛細血管，釋放炎性介質、活性氧代謝產物和蛋白酶等物質，造成肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷[21]。本研究通過測定小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量來評估肺泡-毛細血管屏障通透性[22]，結果顯示：與對照組相比，ALI組中肺灌洗液中的蛋白濃度升高，ALI+IL-4治療組肺灌洗液中蛋白濃度較ALI組降低，但未達到統計學差異。李維維等[23]研究發現：IL-4組小鼠肺泡灌洗液蛋白濃度明顯減少，說明IL-4可以改善ALI小鼠肺毛細血管通透性。

綜上，通過前期研究及動物實驗，本研究發現IL-4可下調機體促炎細胞因子的分泌水平，調節炎癥反應，減輕ALI肺部組織損傷，減輕毛細血管內皮細胞及肺上皮細胞損傷，因此在ALI中具有一定的保護作用。Wehrmann等[24]研究發現，IL-4 表達會降低常駐肺泡巨噬細胞產生的 TNF-α，從而減少肺部巨噬細胞的積累、炎癥和肺泡毛細血管泄漏。段曉光等[25]也有研究表明，提高抗炎因子IL-4水平可有效減輕LPS誘導ALI大鼠的肺部炎癥反應。因此，IL-4在ALI發生發展過程中可能具有一定的保護作用，具有進一步研究及探討的價值。