上皮間質轉化與乳腺癌干細胞的關系

吳婷月， 陳雯敏， 陳策實

(1.中國科學技術大學 生命科學與醫學部， 安徽 合肥 230026； 2.中國科學院昆明動物研究所 云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室， 云南 昆明 650221； 3.中國科學院大學 存濟醫學院， 北京 100049； 4.昆明醫科大學 生物醫學工程研究院， 云南 昆明 650504； 5.云南省腫瘤醫院， 云南 昆明 650118)

專家簡介：陳策實，昆明醫科大學研究員，中國科學院昆明動物研究所客座研究員，博導。獲得中國自然科學基金委“杰出青年”基金，國家科技創新領軍人才和云南省云嶺學者稱號，榮獲云南省和重慶市科技進步一等獎。主持國家自然科學基金重點項目，科技部重點研發計劃項目首席科學家。長期從事乳腺癌、泛素化、干細胞、動物模型和抗癌藥物等方面研究，發表SCI論文130余篇，獲得發明專利3項，被引用7 000多次。任InternationalJournalofBiologicalSciences執行主編，CancerScience副主編。擔任中國抗癌協會乳腺癌專業委員會常委和中國細胞生物學會理事。

乳腺癌是發生在乳腺上皮的一種惡性腫瘤，是女性中最常見的腫瘤。目前乳腺癌的治療策略包括了手術、化療、放療、內分泌治療、靶向治療及免疫治療等。然而，許多晚期患者仍然面對腫瘤轉移、疾病復發以及耐藥，最終導致死亡，這是因為部分乳腺癌細胞可以獲得腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)特性，從而增強其抗化療或放療的能力，放化療后乳腺癌干細胞(breast cancer stem cell, BCSC)在腫瘤中比例的上調，進一步增加了腫瘤的異質性，從而導致治療失敗或者腫瘤復發轉移[1]。腫瘤細胞的異質性給癌癥治療提出了巨大的挑戰。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞獲得間充質表型的過程，允許上皮細胞脫離原發腫瘤部位并向遠處轉移。在乳腺癌中，這2個過程也是緊密相連的，大量研究顯示經歷EMT的細胞具有干細胞特性，具有干性的腫瘤細胞也表達EMT標記[2]。最近，EMT被發現是一種動態的、混合的上皮和間充質狀態，這種狀態下上皮和間充質是共存的，與癌癥進展和干細胞特性密切相關[3]。這些研究提示EMT信號參與了BCSCs的形成和維持。

乳腺癌細胞同時受益于這2種特性提供的優勢，并表現出更高的轉移能力和抵抗不同治療方式的能力。然而，關于EMT和BCSCs的關系到底如何？為什么EMT會增加乳腺癌細胞的干性？EMT發生為什么會導致乳腺腫瘤復發、轉移及耐藥？EMT的可逆過程間質上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)和BCSCs又是什么關系？如何通過靶向EMT過程實現對BCSCs的靶向治療？本文就上皮-間充質可塑性與BCSCs之間的聯系，以及針對這些過程的潛在治療策略作一綜述。

1 乳腺癌干細胞導致腫瘤可塑性

腫瘤內異質性可以由腫瘤干細胞理論解釋，腫瘤干細胞可以由3個功能來定義：腫瘤的起始、長期自我更新能力和分化的能力[4]。當CSCs被注射到免疫缺陷的小鼠體內時，他們有能力比大量的、分化的腫瘤細胞更高效地產生腫瘤[5]，因此CSCs可以啟動和促進原發腫瘤生長，驅動遠端部位的轉移。腫瘤干細胞最早是從急性髓系白血病患者的血液中分離出來的[6]，后來AL-HAJJ等[7]于2003年首次在乳腺腫瘤中使用CD24-CD44+的細胞表面標志物分離乳腺癌干細胞，在這個群體中，只有200個乳腺癌干細胞就能在免疫缺陷的小鼠中形成腫瘤。隨后的十幾年，科學家分離和鑒定出了各類BCSCs的標記物，包括了造血干細胞抗原CD133、CD90、CD166、上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、同源盒轉錄因子NANOG(nanog homeobox )、八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor，OCT4)、巢蛋白(nestin)、富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)、整合素相關蛋白(CD47)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)、蛋白C受體(protein C receptor，PROCR)、四跨膜蛋白8(tetraspanin 8，TSPAN8)、乳腺癌抵抗蛋白(ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)及SGCE(epsilon-sarcoglycan gene)[8-10]等，為實現BCSCs的靶向治療提供了新的策略。

BCSCs存在至少2種不同的可逆的狀態。第一種狀態是間充質樣狀態，BCSCs表達細胞表面標志物CD24-CD44+，它們主要是靜止的，低增殖的，位于腫瘤侵襲邊緣，并表達間充質標志物，具有高侵襲能力；第二種狀態是類上皮樣狀態，表達乙醛脫氫酶(ALDH)，具有高增殖潛力和多譜系分化能力，并表達上皮標志物，位于更中心的位置。間充質樣BCSCs的基因表達譜類似于基底干細胞，而上皮樣BCSCs的基因表達譜類似于正常乳腺的管腔干細胞[11]。雖然以CD24-CD44+或ALDH表達為特征的細胞之間存在顯著差異，但這2個群體都具有腫瘤起始能力，這是它們共同的干性特征。而這2個群體通常是相互獨立的，雙陽性細胞比例在腫瘤中非常低，同時具有CD24-CD44+和ALDH標志物的BCSCs具有最大的致瘤能力。BCSCs具有可塑性，能夠在EMT和MET狀態之間轉換，這種轉變被認為是腫瘤轉移的關鍵，并可能受到腫瘤微環境(tumor micro-environment，TME)中細胞因子信號調節[12]。

BCSCs與化療耐藥和乳腺癌轉移復發有關。目前使用的大多數療法針對的是高增殖的乳腺癌細胞，旨在殺死盡可能多的乳腺癌細胞以減少腫瘤大小，最初可能是有效的，但隨著時間的推移，存活的BCSCs會導致腫瘤復發。BCSCs表達各種蛋白質如ABC轉運蛋白，可以將藥物泵出細胞，從而導致治療耐藥[13]。BCSCs的基因表達譜顯示具有增加轉移潛能的侵襲性基因特征[14]，在小鼠異種移植模型中，轉移到肺的人乳腺癌細胞表達高水平的干細胞標志物CD44，強烈提示BCSCs的促轉移作用[15]。腫瘤微環境也可以調節BCSCs異質性和可塑性，并進一步影響治療耐藥性，但BCSCs如何從EMT獲得耐藥性尚不清楚。

2 EMT促進乳腺癌轉移和復發

EMT是上皮細胞改變其表型的過程，失去主要的上皮細胞特征，轉換為表達間充質標志物的細胞。上皮細胞的特征是頂端-基底端的極性和相鄰上皮細胞之間緊密的連接，表達鈣黏蛋白E(E-cadherin)、緊密連接蛋白(claudins、ZO-1、occludin)、橋粒蛋白(desmoplakin)等特征性分子，有利于組織的完整性和穩定性；相反，間充質細胞表現為成纖維細胞樣、拉長的和紡錘形的外觀，表達鈣粘蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、α-肌動蛋白(α-SMA)等特征性分子導致更多的移動性來增加細胞的遷移能力[16]。通過形態的轉變，細胞獲得了遷移到目的地的能動性。EMT發生在各種生理和病理條件下，包括正常發育、組織形態發生和修復、組織重建、纖維發生和腫瘤發生。重要的是，EMT過程已經被證明與正常細胞和癌細胞中干細胞特性的獲取有關系[17]，并增強了對化療、電離輻射和激素治療的抵抗力。

在EMT介導的癌細胞轉移中，上皮狀態相關基因表達受到抑制，同時激活間充質狀態相關基因的表達。EMT使癌細胞獲得侵襲能力，它們分泌有助于侵入的基質金屬蛋白酶，細胞經歷全身播散并到達繼發性腫瘤部位，再經歷MET過程，使間充質細胞恢復為上皮樣細胞，癌細胞定植并形成轉移灶——即EMT促進腫瘤擴散，而MET促進遠端轉移灶的形成[18]。

在該領域廣泛傳播的一種誤解是EMT意味著從上皮細胞到間充質樣細胞的完全轉分化。然而，大量報告表明，大多數腫瘤中存在中間EMT狀態，細胞在不經歷完全EMT的情況下獲得一些間質特性[19]，EMT和MET過程代表著動態上皮可塑性途徑的兩種最終終點狀態。因此，中間EMT狀態可能出現在轉移的不同階段，細胞在腫瘤擴散過程中通過混合E/M狀態過渡。

未分化的乳腺干細胞，又稱為腫瘤起始細胞，它們可以來源于經歷EMT和隨后的自我更新、擴散和繼發腫瘤發生的基底乳腺上皮細胞(MECs)。發生EMT的細胞和干細胞的基因表達譜之間的驚人相似性也表明EMT與BCSCs的干性之間存在密切聯系[20]。此外，腫瘤細胞中較高水平的EMT標志物不僅促進腫瘤侵襲和轉移到遠處，而且還由于其對化療和放療的相對抵抗力而導致腫瘤復發[21]。

3 EMT賦予乳腺癌細胞CSC特性

盡管有大量關于誘發EMT或干性的信息，但很少有研究精確地指出在機制上，EMT如何誘發干性。總體而言，EMT通過改變乳腺癌細胞的基因表達譜，調控與干性相關基因的表達，使得乳腺癌干細胞在腫瘤起始、轉移、耐藥和復發的各個方面都受到影響。

激活EMT程序可以直接增強腫瘤的起始，產生乳腺癌干細胞。Mani及其同事[2]的一項研究顯示，在永生化的人乳腺上皮細胞中誘導EMT可以增加體外的乳腺球體形成和體內的致瘤性，EMT可能是控制CD44-CD24+細胞向CD44+CD24-細胞過渡的重要步驟，CD44-CD24+乳腺上皮細胞是非致瘤性細胞，可通過激活Ras/MAPK途徑誘導EMT，獲得CD44+CD24-干細胞特征[22]。多個EMT相關轉錄因子可以通過激活或抑制基因轉錄來調控EMT相關基因的表達，也促進干性基因的表達。此外，誘導EMT的相關通路如TGF-β、Wnt都誘導EMT的同時增加干性，激活相關干細胞信號通路。

EMT使得乳腺癌細胞某些特性發生轉變從而促進了乳腺癌的轉移。研究表明，發生EMT的腫瘤細胞具有很強的運動能力，常常與腫瘤細胞的高淋巴結轉移、高侵襲性等有關，下調E-cadherin的表達能夠明顯增強乳腺癌轉移能力，而給予外源性E-cadherin則抑制乳腺癌轉移[23]。通過雙重組酶譜系追蹤系統，結合實時成像和RNA測序，在轉移性乳腺癌MMTV-PyMT小鼠模型中跟蹤經歷部分或完全EMT的癌細胞，發現實際上是部分EMT狀態介導結合了高效轉移過程所需的可塑性和干細胞特征[24]。乳腺癌細胞經歷EMT形成的CD44+CD24-BCSCs，也具有更強的轉移能力。有研究表明，CD44在有肺轉移的乳腺癌腫瘤細胞中的表達明顯增加[11]。在CD44+CD24-BCSCs中，表達CD44異型(CD44v)的一個亞群的肺轉移能力又明顯高于表達CD44標準異型(CD44s)的亞群，通過調控上皮剪接調控蛋白1(epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1)的表達，增加或降低乳腺癌細胞的CD44v/CD44s比值，可在不影響癌細胞干性的情況下促進或抑制肺轉移[25]。此外，TGF-β信號轉導是促進腫瘤細胞EMT與侵襲遷移的主要誘因，研究表明短時間暴露在轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)刺激下，上皮細胞和癌細胞會發生可逆的部分EMT，導致間充質基因上調，播散和轉移能力增強。后來發現在長時間TGF-β暴露的狀態下，能激活mTOR信號通路，促進乳腺上皮細胞和癌細胞穩定的EMT，并且穩定的EMT伴隨著穩定的干細胞生成和抗腫瘤耐藥性的增強[26]。然而，EMT與干性和轉移的聯系仍在爭論中。有新觀點認為EMT在癌癥轉移過程中不是必須的，例如Liu等人[27]發現EpCAM+的細胞而不是EMT的細胞負責了乳腺癌的轉移，ALDH+細胞也比ALDH-細胞具有更高的轉移能力，這些研究結果提示臨床模式應考慮基于其EMT表型的不同亞群作為多靶點治療，以減少治療耐藥性和轉移性增長。

經歷EMT的乳腺癌細胞具有類似干細胞的特性，對多種治療藥物產生耐藥性。部分和完全EMT細胞在原發性腫瘤的化療后都富集，但與部分EMT細胞相比，完全EMT細胞對轉移瘤的化療更具抵抗力[24]。現在認為EMT誘導治療耐藥性主要是由于TGF-β和一些EMT轉錄因子(EMT transcription factor，EMT-TF)在激活促生存信號、增強DNA損傷修復、通過ABC轉運蛋白促進多藥耐藥等方面發揮作用。TGF-β可以通過促進谷胱甘肽代謝從而降低治療效果，提高腫瘤細胞的存活率[28]。過表達EMT-TF也證明可以增強ABC轉運體的外排活性，從而促進多藥耐藥，并且EMT-TF如Twist家族BHLH轉錄因子(twist family BHLH transcription factor ，Twist)、Snail家族轉錄因子1(snail family transcriptional repressor 1，Snail)和叉頭框C2(forkhead box C2，FOXC2)等在多個ABC轉運蛋白基因的啟動子區域都具有結合位點[29]。此外，EMT還與乳腺癌耐藥蛋白ABCG2高度相關，ABCG2與N-cadherin表達呈正相關，與E-cadherin表達呈負相關，可能共同參與乳腺癌細胞的耐藥及轉移[30]。Snail1介導的EMT可以通過調節參與細胞死亡和維持細胞干性的基因，賦予癌細胞耐藥性和細胞可塑性，提示治療耐藥的細胞可以通過激活EMT進入CSC狀態[4]。抑制關鍵的CSC標記物，如ABC轉運體、NANOG、CD44、Wnt、CD55、CD133、ALDH1、OCT4、SOX2(SRY-box transcription factor 2)或Kruppel樣因子4(kruppel-Like factor 4，KLF4)，可使癌細胞對化療敏感。

EMT與乳腺癌復發密不可分。增殖活躍的BCSCs(類上皮狀態)在常規的放化療中往往被殺滅，但靜息狀態的BCSCs(間充質狀態)能夠存活下來[12]。EMT的激活使得殘留BCSCs引起腫瘤的復發。例如白細胞介素-30(interleukin-30，IL-30)可以通過C-X-C基序趨化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10)和IL-23自分泌循環喂養乳腺癌干細胞，通過塑造免疫環境調節BCSCs活力[31]，乳腺癌患者術后排出的傷口液體中也富含大量的細胞因子，可以通過激活信號轉導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路進而誘導干細胞表型的乳腺癌富集，引起術后腫瘤的復發[32]。

這些研究證實了干性和EMT確實是錯綜復雜的，在腫瘤細胞中誘導EMT不僅促進干性，腫瘤細胞侵襲和轉移，而且還有助于耐藥性。因此，增加對EMT-BCSCs鏈接的機制理解將允許開發用于根除腫瘤的新療法，以提高被診斷患有乳腺癌癥的患者的總體生存率。靶向EMT以消除BCSCs為乳腺癌治療提供了一個有希望的途徑。

4 調節乳腺癌細胞干性和EMT的因素

4.1 轉錄因子

已有許多文獻記載EMT相關轉錄因子，包括鋅指蛋白家族Snails(Snai1，Snai2/Slug，Snai3/Smuc)、E-box結合蛋白Zebs(Zeb1/Tcf8，Zeb2/Sip1)、堿性螺旋-環-螺旋蛋白Twists(Twist1，Twist2)和叉頭盒蛋白FOXCs(FOXC1，FOXC2)等可以通過激活或抑制基因轉錄來調控EMT相關基因的表達，進而調控腫瘤干細胞的基因表達，在維持干性方面發揮關鍵作用，特別是Twist和Snail。例如Wang等[33]研究表明轉錄因子Twist可以通過轉錄誘導蛋白酶激活受體1(protease activated receptor 1，PAR1)表達，抑制Hippo通路，激活Yes1相關轉錄調控因子(Yes1 associated transcriptional regulator，YAP)/具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)，誘導乳腺癌細胞發生EMT、侵襲、遷移、干性、腫瘤生長和轉移。另一轉錄因子Slug也可以通過上調NF-κB/ HIF1-α軸，使乳腺癌細胞具有干細胞樣表型[34]。

這些EMT-TF經常協同作用來調節共同靶基因的表達，還經常控制彼此的表達。例如，Snail是一個上游轉錄因子，可以誘導多種其他EMT-TF的表達，包括Slug、Twist1和ZEB1。另一方面，轉錄因子3(transcription factor 3，TCF3)作為一種下游效應因子，其表達受多種其他EMT-TF的誘導，如Snail、Slug和ZEB1[35]。由于這些相互作用，形成一個錯綜復雜的網絡，最終在許多情況下誘導與EMT相關的基因譜變化。

EMT和干性之間的關系不是單行道。一些研究報道了腫瘤干細胞中關鍵轉錄因子對EMT的調控作用。干細胞關鍵轉錄因子SOX2在細胞命運決定中發揮中心作用，并在腫瘤發生和轉移中作為調節因子發揮重疊作用，SOX2的表達可下調轉移抑制因子miR-452，后者直接靶向Slug的3′UTR區抑制干細胞擴增[36]。另一干細胞轉錄因子OCT4也被報導在晚期乳腺癌患者中高表達，和Smad3形成異二聚體促進Snail、Slug的轉錄，與TGF-β信號通路共同誘導EMT[37]。在PyMT-TCF3條件基因敲除小鼠模型和衍生的原代腫瘤細胞系中TCF3的靶向敲除抑制了PyMT驅動的乳腺腫瘤的起始能力和去分化潛能，并嚴重損害了轉移能力，機制研究表明E2A的作用是通過上調Snai1轉錄介導的[35]。除此之外，KLF4、Myc(BHLH transcription factor)、NANOG、Bmi1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)等干性相關轉錄因子也被證明在EMT上發揮調節作用。有趣的是，KLF5轉錄因子也維持乳腺(癌)干性[38]，上調Slug的轉錄，但是KLF5并不促進EMT過程。這些結果說明EMT和干性雖然很多情況下耦聯但是并不完全等同。

轉錄因子的表達在翻譯和翻譯后水平上受到調節，在非編碼RNA、信號通路、腫瘤微環境等多個層面上受到不同的上游調控機制的控制，通過協同調控這些轉錄因子調控EMT和干性的激活(詳見后敘)。

4.2 表觀因子

4.2.1組蛋白修飾酶 越來越多的證據表明，許多組蛋白甲基轉移酶和去甲基化酶參與了乳腺癌EMT和細胞干性的調節。精氨酸甲基轉移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)可以通過甲基化KLF5來阻止其磷酸化、泛素化及降解，從而促進乳腺癌干細胞的維持和增殖[39]。賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine-specific histone demethylase 1，LSD1)也發現能夠在EMT中誘導廣泛的基因表達譜變化，LSD1可能通過癌癥相關成纖維細胞(cancer sssociated fibroblasts，CAFs)間接作用調節腫瘤微環境來調控BCSCs的自我更新[40]。事實上，眾多的組蛋白甲基化修飾酶包括zeste同源物增強子2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)[41]、賴氨酸甲基轉移酶5C(lysine methyltransferase 5C，KMT5C)[42]、核受體結合SET結構域蛋白3(NSD3)[43]、去甲基化酶PHD手指蛋白8(PHD finger protein 8，PHF8)[44]等都能與EMT-TFs相互作用，形成一個精細調控的網絡，對眾多相關基因表達產生調控。

EMT-TFs還受到組蛋白乙酰化的調節。例如在乳腺癌中，乙酰轉移酶CREB結合蛋白(CREB binding protein，CBP)可以通過催化HAT結構域直接與Slug的C端結構域相互作用，介導Slug在轉移性乳腺癌細胞中高度乙酰化[45]。異粘蛋白(metadherin，MTDH)也可以通過促進Twist1啟動子上的組蛋白H3乙酰化而間接激活Twist1的表達，促進CSC積累和乳腺致瘤性[46]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)被證明可以通過抑制IL-6/STAT3和KLF5抑制乳腺癌轉移和生長[47]。

在癌癥進展過程中，泛素化和去泛素化通過異常信號放大發揮關鍵作用。E2泛素結合酶如UBE2O(ubiquitin conjugating enzyme E2O)[48]、E3泛素連接酶如COP1(constitutive photomorphogenic protein 1)[49]、HECTD1(HECT domain E3 ubiquitin protein ligase 1)[50]、CRL4B(cullin 4B)[51]等都被證明通過EMT和/或干性調節乳腺癌進程。此外，大量去泛素化酶(DUBs)也在其中發揮關鍵作用。例如在IL-6條件下，去泛素化酶DUB3能夠對Snail和Slug去泛素化，穩定二者進而促進EMT和增加腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移[52]。相反，抑制去泛素化酶USP34可上調N-cadherin、p-Smad3、Snail和β-catenin，下調E-cadherin，導致侵襲性行為的獲得，并通過增強乳腺球形成能力促進干細胞的形成，同時上調NANOG、OCT4和SOX2 mRNA的表達[53]。

4.2.2DNA甲基化 DNA甲基化是許多病理機制發生的根源。乳腺癌中的低甲基化和腫瘤抑制基因的高甲基化會增加患癌的風險，表觀基因組學研究表明BCSCs和非BCSCs的DNA甲基化存在差異[54]。BCSCs相關基因CD44、CD133也被證明在原發性乳腺癌啟動子區域中低甲基化，并與TNBC和浸潤性乳腺癌相關[55]。EMT-TFs表達同樣受DNA甲基化的調控，尤其是DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介導的甲基化。Snail能與DNMT1、DNMT3a和DNMT3b相互作用，負責E-cadherin啟動子上的DNA甲基化和轉錄抑制，阻斷Snail介導的這種表觀遺傳調控會導致E-cadherin重新表達，逆轉EMT[56]。同時，DNMT1對乳腺和腫瘤干細胞的維持和腫瘤發生至關重要，例如DNMT1介導的FOXO3a(forkhead box O3)啟動子高甲基化導致乳腺癌中FOXO3a表達下調，而FOXO3a能通過抑制FOXM1/SOX2信號傳導來抑制BCSC特性和致瘤性[57]。

4.2.3非編碼RNA MicroRNA是高度保守的、小的非編碼的、單鏈的20～25個核苷酸的RNA，可以通過翻譯抑制或mRNA降解抑制靶基因的表達，在腫瘤的分化、增殖、凋亡等多種生物學過程中發揮重要作用。越來越多的證據支持miRNA與EMT相關，尤其是乳腺癌中的miR-200家族，包括了miR-200a/b/c、miR-141和miR-429等。過表達miR-200可導致癌細胞轉移潛能降低，并通過其3’UTR區沉默Zeb表達，增強E-cadherin的表達，獲得上皮特征[58]。此外，miRNA同時對BCSCs的多種細胞功能具有強大的影響，在BCSCs自我更新和分化的調控中發揮重要作用。提示miRNA在調節乳腺癌干細胞和EMT進展中發揮了重要作用(表1)。Wu等[59]提出EMT可以通過抑制miR-200c促進過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(PPARG coactivator 1 alpha，PGC1α)介導的線粒體融合蛋白(mitofusin 1，MFN1)的激活，MFN1與細胞極性蛋白復合物相互作用，介導內吞銜接蛋白(NUMB endocytic adaptor protein，NUMB)磷酸化和從皮質膜分離，指導不對稱細胞分裂，增強谷胱甘肽的合成和活性氧清除能力，使自我更新的干細胞池得以維持，直接增強腫瘤的起始，產生BCSCs。除了miR-200家族之外，其他抑癌miRNA在BCSCs和EMT調控中也發揮了重要作用。維持細胞分化狀態的miRNA let7可以抑制干細胞所需的因子，Wang等[60]證明Snai1的過表達導致miRNA let-7水平的降低，并足以將檢測到的癌細胞表型向干細胞轉移，Snai1的敲除會導致let-7表達的恢復、干性的減少和腫瘤的生長，提示EMT促進干性的一個機制是通過丟失let-7，破壞分化狀態的穩定。

除了抑癌miRNA，大量促癌miRNA也發揮了重要作用。低氧微環境可誘導miR-210上調，通過靶向E-cadherinmRNA的開放閱讀框區和上調Snail來抑制E-cadherin的表達，促進乳腺癌干細胞轉移、增殖和自我更新[61]。miR-5188通過直接靶向FOXO1，增強Wnt/β-catenin/c-Jun信號通路，刺激已知的Wnt靶標、EMT標記物以及癌癥干細胞的激活，原癌基因c-Jun還可以增強miR-5188的轉錄，形成正調控環，證明miR-5288在體內和體外誘導乳腺癌干細胞、增殖、轉移和化療耐藥發揮致癌作用[62]。這些研究都表明，miRNA是調節EMT和細胞干性的重要表觀遺傳因子。

另一種長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)在EMT和干性之間的調控也發揮了重要作用，LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的轉錄產物，通過調控表觀遺傳、轉錄或轉錄后基因調控機制，在發育、穩態、干細胞多能性、細胞生長和凋亡、腫瘤轉移等多種細胞過程中發揮重要作用。乳腺癌中，lncRNA在介導EMT和BCSCs中也發揮了重要作用(表2)。例如，缺氧誘導的Runt相關轉錄因子2(RUNX family transcription factor 2，RUNX2)可轉錄激活lncRNA RBM5-AS1，通過阻止β-catenin降解，在體內和體外促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲、EMT和干細胞維持[83]。

表1 miRNA在調節乳腺癌干細胞和EMT進展中的作用Tab.1 The role of miRNA in regulating the progression of Breast cancer stem cells and EMT

lncRNA可以直接或間接地調節包括miRNA在內的其他非編碼RNA的調控作用，其作用也有可能根據不同的miRNA發揮致癌或者抑癌的作用。例如LncRNA HOTAIR，可以通過調節miR-129-5p/FZD7軸[84]或miR-34a/SOX2軸[85]促進乳腺癌增殖、遷移、侵襲、EMT以及干細胞集落形成能力，也可以通過抑制HoxD10(homeobox protein Hox-D10)的表達間接下調miR-7的表達，通過直接靶向致癌基因SETDB1(SET domain bifurcated 1)，抑制細胞的侵襲和轉移，減少BCSCs數量，并部分逆轉了MDA-MB-231細胞中的EMT[76]。

4.3 關鍵信號通路

EMT過程和干性是多條信號轉導途徑和多種觸發因素綜合作用的結果，TGF-β、Wnt、Notch、Hippo、NF-κB、Sonic Hh(Shh)和IL-6/STAT3等信號通路均可以激活EMT并促進BCSCs產生(圖1)。

表2 lncRNA在調節乳腺癌干細胞和EMT進展中的作用Tab.2 The role of lncRNA in regulating the progression of Breast cancer stem cells and EMT

圖1 參與乳腺癌EMT和干性的相關信號通路Fig.1 Signaling pathways involved in EMT and stemness in breast cancer

4.3.1TGF-β信號通路 TGF-β信號通路在促進EMT和干性上發揮了至關重要的作用。早期腫瘤中，TGF-β主要表現為抑制腫瘤增殖，在腫瘤進展期又會促進腫瘤的侵襲轉移[101]。在經典的Smad通路中，TGF-β信號激活Smad2和Smad3，并與Smad4結合，而Smad復合物將轉移到細胞核內與轉錄因子一起介導靶基因的抑制或激活。在TGF-β信號介導的非Smad信號通路中，它可以激活PI3K-AKT-mTOR信號進行轉錄調控從而達到觸發EMT的效果。TGF-β誘導包括Snail、Slug、Twist等多種EMT轉錄因子，因此，TGF-β被認為是在發育過程、癌癥及其他病理狀態下誘導EMT最重要的因子。

同時，TGF-β可以特異性的激活乳腺癌干細胞基因網絡，促進乳腺癌擴散，與病人較差的存活率相關聯。有學者證實乳腺癌細胞中的miR-30a與轉錄因子SOX4形成雙負環，在體內外通過阻斷TGF-β/Smad信號通路同時抑制乳腺癌中的EMT和干細胞樣表型[102]。同樣值得注意的是，Cdc2樣激酶4(CDC like kinase 4，CLK4)沉默同樣抑制了由TGF-β信號傳導誘導的侵襲性和癌癥干細胞特性[103]。輻射也可以誘導TGF-β信號的激活，表達Vimentin、Fibronectin、Snail、Slug、Twist、N-cadherin等EMT標志物，增強CSC特性和上調活性氧標志物NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)，增強體外和體內乳腺癌細胞的運動性[104]。TGF-β與Notch、Wnt/β-catenin、NF-κB和RTK等信號通路的相互作用參與了EMT的誘導，進一步幫助維持轉移性腫瘤細胞的間充質表型和干性[105]。

4.3.2Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin通路的過度激活驅動乳腺癌的發生進展，也促進乳腺癌細胞發生上皮-間質轉化。當Wnt分子與跨膜受體(Frizzled家族分子和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low-density-lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6))結合后，通過受體與一系列胞質蛋白(軸抑制蛋白(axis inhibition protein ，AXIN)、大腸腺瘤息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、β-連鎖蛋白(β-catenin)等)的相互作用使β-catenin在胞漿內累積并轉運入核，與核內轉錄因子TCF/LEF1(T-cell factor/lymphoid enhancer factors)共同作用，激活下游靶基因的轉錄，導致Snail的累積和E-cadherin下調，引發EMT。抑制Wnt通路可促進上皮分化并抑制Twist和Slug所致的EMT，而Wnt/β-catenin通路的異常激活可促進正常干細胞的惡性轉化，多數β-catenin靶基因如YAP[106]、整合素α5(integrin α5，ITGA5)[107]等都可以促進干性特征的形成。

細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)缺失可通過Wnt/β-catenin途徑部分上調上皮細胞黏附分子EpCAM表達，從而促進部分EMT，增強乳腺癌干細胞性[108]。成體干細胞標記LGR5[109]、線粒體應激蛋白Mortalin[110]也被證明通過激活該經典信號通路，促進乳腺癌細胞遷移、腫瘤形成和EMT，維持BCSCs的干性。最近研究表明缺氧誘導的RUNX2可轉錄激活Wnt/β-catenin信號通路[111]，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)還可以直接激活缺氧乳腺癌細胞的鈣質網蛋白(calreticulin，CALR)轉錄，激活Wnt/β-catenin信號通路促進BCSCs，從而增加腫瘤的起始和轉移[112]。

4.3.3Notch信號通路 Notch信號通路調控細胞增殖、分化、凋亡之間的平衡，在決定細胞命運和維持祖細胞群方面發揮重要作用。到目前為止，Notch受體、配體的突變、缺失、擴增或過表達，以及越來越多的下游Notch激活基因已經被描述為與大多數人類癌癥相關。Notch通路是通過Delta-like(DLL1、DLL3、DLL4)和Jagged(JAG1、JAG2)家族成員作為配體與Notch受體(Notch1-Notch4)結合而激活的，這種結合通過γ分泌酶觸發一系列蛋白水解切割事件，產生活性Notch細胞內結構域(notch intracellular domain，NICD)易位到細胞核，與其他轉錄激活劑結合激活典型的Notch靶基因的轉錄。

在乳腺癌中，Notch信號通過多種機制激活EMT和干性。Notch1信號通路激活Slug表達，促進乳腺癌細胞遷移和侵襲，Notch1的過表達還激活STAT3誘導CSC樣表型和EMT[113]。Notch4在三陰性乳腺癌中的異常高表達和激活也有助于間充質型BCSCs的維持，通過轉錄上調Slug促進EMT。Notch4標記ML-BCSCs的效率明顯高于目前常用的CD24-CD44+標記物，成為腫瘤干預的潛在靶點[114]。相反，部分Notch受體起抑制作用，例如HIF1α可以接結合Notch3啟動子上調Notch3的表達，隨后通過降低表達Notch3的乳腺癌細胞中IL-6的水平從而下調BCSCs[115]。還有一些miRNAs對Notch誘導的EMT和干性有負面影響。miR-34a通過下調Notch1負向調控細胞增殖、遷移、侵襲和乳腺癌干細胞增殖，miR-34a的表達與乳腺癌組織中腫瘤分期、轉移及Notch1的表達呈負相關[116]。

4.3.4NF-κB信號通路 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種參與炎癥、免疫、細胞穩態和腫瘤進展的促炎細胞因子，參與腫瘤發生的所有步驟，它激活NF-κB，誘導如Snail，Slug，Twist，ZEB1和ZEB2等EMT相關因子的轉錄。TNF-α可迅速誘導正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中Twist1 mRNA和蛋白的表達，且Twist1的表達需要IKK-β和p65的參與[117]。EMT相關的TF Twist2轉錄也可以導致NF-κB的活化，反過來上調Twist2的表達，從而實現一個正反饋回路，激活EMT，并增強基底樣乳腺癌中的癌癥干細胞樣特性[118]。此外，EpCAM的糖基化修飾也被證明通過促進乳腺癌細胞中的NF-κB，在缺氧條件下誘導干性和EMT[119]。一些miRNA同樣可以通過NF-κB通路調控表達，例如細胞外囊泡中包裹的miR-370-3p通過與CYLD的3'UTR結合下調表達，激活NF-κB信號通路，乳腺癌細胞來源的外泌體還能促進正常成纖維細胞的激活，而活化的成纖維細胞促進癌細胞的干性、遷移、侵襲和EMT的增強[120]。miR-221/222通過靶向PTEN，進而激活Akt/NF-κB/COX-2通路，促進乳腺癌細胞生長、遷移和侵襲，在BCSCs增殖和腫瘤生長中發揮關鍵作用[121]。有研究還發現TNF-α還可以通過激活非經典NF-κB通路，上調TAZ表達從而增加乳腺癌干性[122]。

4.3.5Hedgehog信號通路 Hedgehog(Hh)信號通路對細胞命運的決定和自我更新至關重要。Hh通過跨膜蛋白Patched(ptch)和Smoothened(Smo)兩種受體信號發揮作用，Smo起到中間橋梁作用。當無Hh信號時，神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白(glioma-associated oncogene homologue, Gli)被水解成小片段進入細胞核抑制靶基因的轉錄；當Hh與Ptch結合時，對Smo的抑制效應解除，Gli降解作用被抑制，Gli繼而從復合體中釋放出來進入細胞核中啟動相關基因的表達。Hh參與多種類型癌癥的發生發展，并負責細胞干性的維持。Zhu等[9]發現TSPAN8可以與PTCH1相互作用，通過招募去泛素化酶ATXN3抑制SHH/PTCH1復合物降解，導致Smo易位到纖毛，促進干性基因的表達并增強小鼠的腫瘤形成。此外，p63可以通過直接結合Shh、Gli2和Ptch1的基因調控區域正向調節并維持BCSCs的自我更新[123]。

同時，大量研究證實Hh信號通路激活與EMT發生有關。表達各種EMT-TF(Snail，Twist，或Zeb1)或敲低E-cadherin，激活EMT程序，可誘導正常和轉化乳腺上皮細胞發生初級纖毛，而EMT可以通過誘導初級纖毛發生和Hedgehog信號通路促進基底乳腺干細胞和腫瘤起始細胞干細胞[124]。在乳腺癌細胞中，激活Hh信號通路后腫瘤侵襲轉移增加，并且CSC相關標記物SOX2、NANOG、OCT4和ALDHA1表達上調，乳腺球形成效率、體外自我更新能力和體內致瘤性提高[88]。抑制含溴結構域蛋白4(bromodomain containing 4，BRD4)[125]或敲除泛素特異性蛋白酶37(ubiquitin specific peptidase 37，USP37)[126]也被證明均可顯著降低Hh途徑成分Smo和Gli-1，從而抑制乳腺癌的干細胞性、細胞侵襲和EMT。有趣的是，最近幾年研究還發現在乳腺癌模型中，EMT細胞可以通過激活Hh通路的Gli轉錄因子誘導弱轉移的非EMT腫瘤細胞以旁分泌的方式增加轉移，但Smoothened抑制劑并不能阻斷這種作用[127]。

4.3.6Hippo信號通路 Hippo信號通路也是調控腫瘤發生發展的關鍵通路，在乳腺癌細胞的增殖、分化、侵襲、上皮間質轉化和干性維持等多個過程起著關鍵性作用。哺乳動物STE20樣激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2，MST1/2)、適配器蛋白Salvador同源物1(salvador homolog 1，SAV1)、大腫瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor1/2，LATS1/2)以及重組人MOB激酶激活因子1(MOB kinase activator 1，MOB1))構成Hippo信號通路的核心反應鏈，彼此之間通過特定的保守結構或磷酸化位點相互作用，抑制下游轉錄共激活因子YAP/TAZ。在乳腺癌中，YAP/TAZ作為Hippo信號級聯的效應因子，可以將癌細胞重組為腫瘤干細胞，促進腫瘤的起始、進展和轉移，同時YAP/TAZ也是細胞物理性質的主要傳感器，接收來自組織結構和周圍細胞外基質的機械信號[128]。

乳腺癌細胞的自我更新和腫瘤起始特性需要內源性TAZ，而TAZ水平的提高促進了CSC特征，將原本良性的實驗腫瘤轉化為更具侵略性的組織病理學表型。TAZ還可能部分通過增加KLF5的穩定性來維持BCSCs的干性[129]。通過抑制YAP/TAZ活性，還可以抑制三陰性乳腺癌細胞EMT和遷移。腫瘤抑制因子CYLD通過協同抑制YAP/TAZ和TGF信號通路抑制乳腺上皮細胞向間質轉化[130]。近年來，開發靶向Hippo通路的抗癌療法已成為一個研究熱點，但目前沒有相關藥物進入臨床，因此，明確Hippo通路調控機制是分子靶向治療研發的重要基礎。

4.3.7IL-6/STAT3信號通路 乳腺癌患者IL-6水平的升高往往與生存期較差相關。IL-6是一種多效能細胞因子，能誘導STAT3活化并將細胞外的信號傳遞到細胞核，通過誘導靶基因轉錄發揮生物學效應，與EMT程序的誘導和增強干性基因相關。三維培養實驗和原位異種移植模型表明，IL-6有效地促進了雌激素受體α(ERα)陽性的人乳腺癌細胞的EMT表型，在體外表現為侵襲性增強，腫瘤細胞增殖指數升高，在體內表現為組織學分級高，分化差[131]。IL-6通過激活STAT3信號轉導可以激活原癌基因PIM1的表達，促進細胞侵襲、上調EMT和干細胞標志物的表達，而抑制STAT3的激活可以消除這種誘導作用[132]。IL-6還通過STAT3介導自主調節線粒體超氧化物水平，維持乳腺癌細胞的干細胞樣活性[133]。已獲審批藥物托珠單抗[134]、中藥魁蒿提取物5-去甲基青花素[135]、商陸根提取物[136]等都證明可以通過IL-6/STAT3信號來抑制乳腺癌EMT和干性。

4.4 腫瘤微環境(TME)

腫瘤微環境是腫瘤細胞賴以生存的復雜環境，包含了免疫細胞、基質細胞、細胞因子和生長因子以及細胞外基質等多種因素，存在顯著低氧、酸性、高壓等生理特點，這些環境因素通過改變細胞的自我更新途徑或通過阻斷關鍵轉錄調控因子的表達，對腫瘤的上皮-間質轉化(EMT)、間質上皮轉化(MET)、腫瘤干細胞的產生以及最后的遠端定植都有重要的作用，從而影響腫瘤組織的惡性進展。

4.4.1免疫細胞 腫瘤細胞能招募許多天然免疫系統的細胞成分，如巨噬細胞、髓源性抑制細胞、調節性T細胞等，這些細胞通過釋放可溶性介質形成腫瘤細胞自身局部環境。腫瘤微環境中的巨噬細胞和腫瘤干細胞之間存在潛在相關性，巨噬細胞作為一個重要中樞，匯聚了許多干性和EMT調節因子的功能。通過單核細胞和乳腺癌細胞共培養的研究以及癌細胞在巨噬細胞衍生出的條件培養液中生長的研究揭示巨噬細胞及其釋放的因子對重塑過程的影響。耗盡小鼠乳腺脂肪墊中的巨噬細胞嚴重損害了乳腺發育中的干細胞能力，幾乎完全阻斷了小鼠模型中腫瘤的啟動[137]，單核細胞與乳腺癌細胞之間形成的接觸以及巨噬細胞釋放的因子對乳腺癌細胞的干性和EMT具有重要的促進作用。例如，Lu等[138]的一項研究表明，在乳腺癌患者的活檢組織中CD68+巨噬細胞位于CD90+腫瘤細胞附近，并且巨噬細胞增強了CD90+CSCs細胞的腫瘤啟動，具有CSCs和EMT的特征，腫瘤細胞表達CD90是腫瘤細胞與巨噬細胞之間產生物理接觸所必需的，這些相互作用增加了癌細胞IL-6、趨化因子CXCL8和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的表達。同時，炎性細胞因子維持CSCs水平，重組IL-6和CXCL8增加CD90+腫瘤細胞形成腫瘤球體，維持干細胞狀態[138]。腫瘤相關巨噬細胞還可以通過高表達的跨膜蛋白LSECtin與其受體相互作用從而增強乳腺癌的干性，靶向這一點也可能為乳腺癌提供潛在的治療[139]。

除此之外，巨噬細胞在不同的組織環境中可分化為兩種截然不同的極化狀態：經典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞，在功能和表型上表現出極大的差異，在EMT和干性調節上也發揮著不同的功能。M1型巨噬細胞是Th1型免疫反應過程中產生的效應巨噬細胞，主要由LPS或IFN-γ誘導，高表達IL-12、IL-23，分泌一氧化氮、反應氧中介物等殺傷分子、多種炎癥因子(IL-1、IL-6、IL-13和TNF-α等)及趨化因子(CCL2、CCL3、CXCL-10等)來吸引CD8和Th1，具有高抗原遞呈能力，參與Th1型免疫應答，殺傷感染病原體[140]。在腫瘤微環境中，M1型巨噬細胞通過分泌炎性因子，活化適應性免疫應答而起到殺傷腫瘤細胞的作用。而M2型巨噬細胞主要由IL-4、IL-10、糖皮質激素等誘導，發揮抗炎的作用，抗原提呈能力差，同時它還可分泌免疫抑制性細胞因子，抑制其它免疫細胞的增殖與活化。當考慮到調節干性和EMT的巨噬細胞的類型時，發現M1型巨噬細胞(主要來自外周血單核細胞，PBMC)的條件培養液被添加到Lumina-A乳腺癌細胞中時，腫瘤細胞獲得了CSCs表型、EMT特性和更強大的遷移[141]。另一實驗證明天然化合物大黃素通過抑制TGF-β1誘導的幾個轉錄因子如FOXC2、NANOG、OCT4、Jagged1和KLF4的表達，阻斷乳腺癌細胞和巨噬細胞之間的促腫瘤前饋作用，減少了巨噬細胞向腫瘤的募集和隨后的M2樣極化，從而改善了腫瘤微環境的免疫抑制狀態。當大黃素在腫瘤細胞接種后不久給小鼠使用時，它可以抑制乳腺腫瘤的生長；而當大黃素在建立的腫瘤之后開始治療時，它對原發腫瘤的生長沒有影響，但顯著減少了肺轉移[142]。因此，巨噬細胞可以通過協調促炎和免疫抑制信號調節CSCs的啟動和維持，M1型巨噬細胞可以誘導分化為CSCs，而M2型巨噬細胞對維持干性有較大的貢獻。

此外，誘導上皮性乳腺癌的免疫反應，可以在體內導致腫瘤的T細胞依賴性生長，且伴隨著EMT的發生，表明EMT可以由CD8+T細胞所誘導，產生的間充質腫瘤細胞具有CD24-CD44+表型，具有BCSCs的特征，具有強致瘤性、高上皮腫瘤重建能力以及對藥物和輻射的耐藥性增強[143]。有趣的是，最近的研究發現CD8+T在免疫逃逸方面也發揮了作用。用Concanamycina預處理破壞CD8+T的溶解顆粒后和乳腺癌細胞共培養，基因表達分析顯示細胞程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-Dioxygenase 1，IDO1)、癌胚抗原相關細胞附著分子1(CEA cell adhesion molecule 1，CEACAM1)和進一步的免疫調節檢查點同時誘導乳腺癌細胞，增加了干細胞樣癌細胞的比例，這種干細胞樣特性的誘導通過增強免疫缺陷小鼠的腫瘤形成能力也得到證實，該機制表明無效的免疫反應不僅不能清除惡性腫瘤，而且還可以激活癌細胞中促進干細胞生長和腫瘤播散能力的途徑，為不成功的免疫治療導致的臨床過度進展現象提供了可能的解釋[144]。

CSCs還可以通過改變TME中IL-6和IL-8以及CCL5等細胞因子的產生來影響輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)/調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)平衡，調控EMT和干性的關鍵轉錄因子STAT3是Th17分化和Treg抑制的關鍵轉錄因子[145]。CSCs和Tregs之間存在正相關，表明這些細胞群之間可能存在串擾以促進免疫抑制環境。Tregs還通過細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)、IL-10和TGF-β的表達，通過TAM介導的EMT誘導促進CSC的擴張[146]。

人和小鼠乳腺CSCs也易受NK細胞毒活性的影響，BCSCs在體內誘導了自體NK細胞的活化和擴增，這與抑制CSC的轉移擴散有關[147]。但并非所有乳腺癌來源的CSCs都對NK細胞毒性有抗性。最近有報道稱，來源于人類乳腺癌的ALDH+CSCs，由于miR20a的表達，可以通過下調殺傷細胞凝集素樣受體K1(killer cell lectin like receptor K1，KLRK1)的配體MHC I類多肽相關序列A(MHC class I polypeptide-related sequence A，MICA)和MICB來逃避NK識別，促進了BCSCs對NK細胞毒性的抵抗并導致肺轉移[148]。

4.4.2脂肪細胞 脂肪組織除了能量儲存的主要功能以外，還是一個復雜的內分泌器官，脂肪細胞也是腫瘤微環境中豐富和活躍的主要成分，在乳腺癌的形成和進展中發揮重要作用。脂肪細胞產生各種各樣的脂肪因子和信號因子，如CXCL2、TNF-α、IL-6、瘦素等，促進腫瘤細胞的自我更新能力和轉移能力。Wang等[149]研究發現人類脂肪細胞來源的瘦素可以激活乳腺癌JAK/STAT3信號通路，STAT3磷酸化入核后與肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1B(carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B)啟動子結合促進其轉錄，促進脂肪酸β氧化從而重塑腫瘤脂質代謝，促使乳腺癌干性，誘發化療抵抗。此外，在MMTV-Wnt-1轉基因小鼠模型上驗證了增加的瘦素信號通過促進腫瘤干細胞富集和上皮-間質轉化來驅動肥胖相關的TNBC的發展。脂肪細胞還可以通過旁分泌IL-6/STAT3信號誘導乳腺癌細胞上皮間質轉化[150]。袁增強團隊研究揭示了在飲食誘導的肥胖癥中，脂肪細胞TAZ通過FFA/PPARγ軸的特異性上調。小鼠脂肪細胞TAZ基因敲除或缺乏通過抑制抵抗素的表達和分泌來抑制脂肪細胞誘導的乳腺癌的增殖和干化[151]。目前，脂肪細胞在乳腺癌中的研究還不成熟，隨著脂肪細胞-癌癥相互作用調控機制的闡明，可能會發現新的藥物靶點。

4.4.3腫瘤相關成纖維細胞 腫瘤相關成纖維細胞作為乳腺腫瘤微環境中主要的基質細胞類型，和癌細胞之間有一種動態相互作用。不同的分泌信號分子將CAF與非腫瘤組織成纖維細胞區分開來。在生物學水平上，CAF表現出一種“激活”的表型，參與癌細胞EMT程序激活[152]。

近年來的幾篇報道提示了CAF激活調節附近癌細胞中EMT程序和干性的潛在機制。CD10+GPR77+CAFs可以通過p65磷酸化和乙酰化而持續激活NF-κB通路，維持癌癥干細胞以促進癌癥形成和化療耐藥[153]。與正常成纖維細胞相比，CAF與乳腺癌細胞共培養可以刺激成纖維細胞產生更高水平的CCL2，激活STAT3，進而誘導NOTCH1表達，刺激乳腺癌細胞干細胞特異性、球形表型和CSC自我更新[154]。

CAFs還可以分泌富含蛋白質、RNA的外泌體來影響腫瘤微環境。研究表明，與正常乳腺上皮細胞相比，乳腺癌細胞通過外泌體釋放更多的生存蛋白(survivin)到細胞外，而激活成纖維細胞，活化的成纖維細胞在體內外都能促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、EMT和干細胞分化[155]，來自CAFs的含有microRNA -181d-5p的外泌體也可以通過調控CDX2/HOXA5促進乳腺癌EMT[156]。

CAFs最近還因其作為免疫細胞募集的調節者而引起關注。與正常成纖維細胞相比，CAFs是表達α-SMA的成纖維細胞，可以由單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)介導有效的招募單核細胞，并表現出較強的免疫抑制，表明CAFs在塑造乳腺腫瘤微環境中發揮著關鍵作用[157]。最新研究還發現在乳腺CSCs中高表達的一種小GTPase Rab13可以控制CXCR1/2的膜轉位，使腫瘤細胞與腫瘤相關的巨噬細胞和癌癥相關的成纖維細胞相互作用，建立一個支持性的BCSC生態位促進乳腺癌干性[158]。

4.4.4細胞因子 腫瘤微環境中大量的細胞因子和趨化因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL8、CXCL1等[63]可以通過旁分泌信號來增強CSCs的活性，參與干性和EMT的調節。在許多研究中，TNF-α直接促進乳腺癌細胞和未轉化的乳腺上皮細胞的干性、EMT和轉移，TNF-α也可以與其他因子如TGF-β、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)聯合使用[159]。除了TNF-α，IL-6也誘導了乳腺癌細胞干性的獲得[160]，JAK/STAT3、Notch通路等都被認為介導了IL-6誘導的乳腺癌細胞的干性的事件中起到關鍵作用。此外，在乳腺癌中發現趨化因子CXCL8-CXCL1/2軸對干性的影響是通過Src反式激活HER2和EGFR來實現[161]。與CXCL8類似，CXCL1被發現以自分泌的形式或由癌細胞附近的巨噬細胞分泌促進細胞干性[162]，且從機制上，NF-κB、STAT3和MAPK幾種不同的信號通路參與了CXCL1誘導的EMT過程。

4.4.5酸性腫瘤微環境 腫瘤微環境一顯著特征就是細胞外酸中毒，pH值在6.5～6.9范圍內，而正常組織常為pH7.2～7.5的堿性外環境。酸性微環境可通過破壞腫瘤的黏附連接，有利于腫瘤的生長、轉移。酸性微環境下腫瘤細胞的原癌基因Src被激活，通過進一步激活蛋白激酶C-δ(protein kinase C-δ，PKC-δ)破壞p-120連環蛋白介導的黏附連接，并降解E-cadherin，使腫瘤細胞與細胞的接觸松散，增加細胞運動和遷移，促進腫瘤轉移[163]。后續研究證明，在不依賴于低氧環境條件下，酸性微環境還可以維持腫瘤干細胞的自我更新能力和未分化狀態，使細胞獲得多能性[164]。乳腺癌干細胞的功能標志物ALDH1A1也可以通過降低胞內的pH值，促進轉化生長因子激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)磷酸化，激活NF-κB信號，并上調GM-CSF的分泌，導致骨髓源性抑制細胞的富集，增強對殺傷性T細胞增殖和活化的抑制作用，促進腫瘤生長[165]。

4.4.6缺氧 缺氧會影響EMT相關基因表達，進一步誘導干細胞表型。氧穩態在癌發生和腫瘤進展中起著關鍵作用。正常組織中足夠的氧氣供應使細胞存活，而在腫瘤組織中，由于腫瘤細胞具有無限的增殖能力，在生長過程中需要消耗大量的能量和氧氣，處于低灌注狀態，造成微環境缺氧。

低氧通常出現在腫瘤血運不良的區域，HIF通過上調EMT相關轉錄因子，激活EMT相關信號通路，調控EMT相關炎癥因子，以及調控其他通路引發EMT。有證據表明，HIF通過誘導E-cadherin、SNAIL、ZEB1、Twist和TCF3[166]的轉錄調控抑制E-Cadherin的表達，從而賦予癌細胞間質屬性，誘導EMT。HIF-1還能通過誘導TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT和Notch等信號通路激活EMT。研究表明，抑制GSK-3β和激活PI3K/Akt通路也可能通過短暫的細胞內活性氧生成增加和HIF-1/VEGF依賴性通路參與缺氧介導的EMT。GSK-3β還可以調控SNAIL易位，控制E-cadherin轉錄抑制[167]。通過調節乳腺癌細胞中的長鏈非編碼RNA Lnc RBM5-AS1[111]也可以調引發缺氧微環境中EMT。此外，研究表明，人乳腺癌細胞在缺氧培養條件下僅暴露2天就足以使BCSCs的百分比增加2倍[168]，KLF4、NANOG、OCT4和SOX2基因表達增加，提示缺氧在調節EMT與細胞干性之間可能存在某種關系。缺氧誘導EMT在腫瘤組織中的出現，而腫瘤細胞在缺氧微環境中表現出干細胞陽性特征。

4.4.7營養與代謝 Warburg效應表明即便在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞依舊采取有氧糖酵解的方式代謝葡萄糖，而其中葡萄糖的含量直接影響腫瘤干細胞的存活，是維持癌細胞干性的關鍵。早期研究發現，腫瘤干細胞相較于分化的腫瘤細胞，葡萄糖的攝取、糖酵解酶的表達、乳酸生產量及ATP含量顯著增加，進行高水平糖酵解進而活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平降低，維持干細胞的穩態[169]。例如調控糖酵解基因表達的關鍵轉錄因子ETS變體基因4(ETS variant transcription factor 4，ETV4)缺失后，顯著抑制了己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDHA)等糖酵解酶的表達，降低乳腺癌細胞對葡萄糖的攝取和乳酸的釋放，而ETV4在BCSCs中富集則通過增強糖酵解活性促進乳腺癌細胞干細胞樣特征[170]。但隨著研究進展，大量證據表明一部分的腫瘤干細胞更偏向于氧化磷酸化而不是糖酵解，具有更低的葡萄糖消耗速率和乳酸產生，但產生更多的ATP[171]。腫瘤干細胞主要依賴糖酵解還是氧化磷酸化，在不同的腫瘤中并不確定。

有氧糖酵解的代謝重編程可由轉錄因子網絡驅動。已經確定的乳腺癌干細胞促進因子如C-Myc[172]、HIF-1α[173]都是促進糖酵解的關鍵轉錄因子，通過驅動靶基因的表達參與代謝重編程。激活的HIF-1α不僅能誘導多能相關轉錄因子(Oct-3，NANOG、SOX-2等)、糖酵解(葡萄糖轉運蛋白1/2(glucose transporter 1/2，GLUT1/2)、磷酸甘油酸酯激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)、丙酮酸激酶(pyruvate Kinase，PKM)等)相關基因的表達，還可以刺激EMT相關分子(Twist、Snail、MMPs、TGF-α等)的表達，在自我更新能力、生存、能量代謝改變、癌細胞的侵襲和轉移和治療耐藥性等方面發揮關鍵作用(PMID: 33850556)[173]。增強的有氧糖酵解產生過量的末端產物乳酸，并對氧化磷酸化產生抑制作用，因此ROS生成減少，從而驅動細胞遷移和細胞骨架重塑，促進了EMT表型的形成和遠處轉移。一些糖酵解酶如果糖二磷酸醛縮酶A(fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA)、M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2，PKM2)、LDHA、LDHA參與上皮標記物的丟失和間充質標記物的獲得，在調節腫瘤代謝的同時，促進癌細胞的間充質轉化[174]。有研究表明，腫瘤干細胞不同亞群的代謝模式也不同，與上皮樣腫瘤干細胞相比，間充質樣干細胞更傾向于糖酵解[11]。

腫瘤干細胞中的脂肪酸代謝也逐漸成為研究熱點，研究顯示，BCSCs中脂肪酸代謝相關酶的表達和活性明顯上調，通過脂肪酸β-氧化調節脂質代謝，高脂飲食能夠增強BCSCs的致瘤能力和惡性轉化[149]。研究發現膽固醇合成增加可以促進乳腺癌細胞干性，與磷脂代謝相關的lncRNA ROPM可以促進BCSCs的磷脂代謝和游離脂肪酸的產生，從而激活PI3K/AKT、WNT/β-Catenin和Hippo/YAP信號，最終參與BCSCs干性的維持[175]。脂質代謝也可以影響乳腺癌細胞的可塑性和轉移。通過蛋白質組學和脂質組學的方法研究上皮和間充質乳腺癌細胞，發現上皮細胞表現出高水平的單不飽和脂肪酸以及脂肪酸從頭合成酶的表達增加，而間充質細胞顯示脂肪生成減少、高水平的多不飽和脂肪酸以及參與三酰甘油合成和脂滴形成的基因表達增加[176]。提示脂肪酸氧化和脂質儲存之間的相互作用可能是細胞狀態變化過程中代謝可塑性的一種表現，類維生素a結合同源核受體可以靶向脂質代謝基因，從而將脂肪酸在間充質細胞狀態下的β-氧化定向到上皮細胞狀態下的脂質儲存。在動物模型中，對脂肪酸氧化的擾動會重新引導脂肪酸通量，促進更多的上皮細胞表型，從而阻斷EMT驅動的乳腺癌轉移[177]。

4.4.8細胞外基質 細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是腫瘤微環境的關鍵組成部分，由蛋白質與糖類等生物大分子在細胞表面或細胞間構成復雜的網絡結構，為腫瘤提供結構上的支持和保護作用。同時，腫瘤細胞影響ECM不斷地動態重塑，為腫瘤組織的生長提供了合適的基質微環境。

ECM的主要組成成分包括膠原蛋白、糖蛋白、多糖等均可調節乳腺癌細胞的EMT和干性，影響腫瘤的侵襲、轉移以及化療抵抗。在膠原蛋白構成的3D微環境中生長的乳腺癌細胞呈現出更強的干細胞特性，上皮間質轉化能力以及癌細胞的致瘤能力[178]。膠原蛋白還可以通過形成剛性ECM后激活AKT/mTOR信號通路，進而增強ERα+BCSCs的干性并促進肺轉移灶的形成[179]。乳腺癌干細胞還能夠自覺分泌糖蛋白例如層粘連蛋白(laminin，LN)與表面的整合素結合后激活TAZ信號，促使更多LN的分泌以維持干性[180]。然而，LN也被證明可以通過激活MAPK/ERK信號通路降低BCSCs的比例[181]，LN對BCSCs的不同調節作用可能與培養環境間的差異有關。ECM中另一常見的黏附性糖蛋白纖連蛋白(fibronectin，FN)在乳腺癌細胞中也被證明可以通過和整合素結合來誘導自身EMT，促進自身轉移并增加干細胞標志物CD44的表達[182]。其中ITGB4作為乳腺干細胞標志物，被認為可以作為一個標記來識別CSC富集的部分間充質癌細胞群，和部分EMT密切相關[183]。CSC表面的CD44分子被認為是多糖成分透明質酸(hyaluronic acid，HA)受體，CD44和HA結合可以啟動下游信號通路轉導，調節BCSCs的特性和功能。有研究發現CD44+BCSC可以產生大量的HA，同時也會上調EMT標志物，沉默Twist表達或抑制TGF-β/Snail信號通路可以阻斷進入干細胞狀態的途徑[184]。探究ECM中不同組分對BCSCs的影響，闡明其在腫瘤進展中的作用，是靶向腫瘤治療的新研究趨勢。

4.4.9細胞外囊泡 細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由各種類型的細胞分泌的納米級顆粒，它攜帶包括蛋白質、DNA、RNA、脂質等多種生物活性物質，介導細胞間通信，并調節包括細胞增殖、存活和轉移等多種細胞過程[185]。最近一項研究表明，間充質干細胞分泌的細胞外囊泡可以指導乳腺癌細胞逐步去分化，從而進入骨髓血管周圍區域休眠。胞外囊泡在與乳腺癌細胞接觸后，細胞外囊泡的內容物發生了改變，使其完全去分化為一個具有CSC特性的群體[186]。脂肪細胞來源的EVs也可以通過調控HIF-1α的活性，增強ER陽性和三陰性乳腺癌細胞的生長、運動、侵襲、干細胞樣特性以及上皮向間充質轉化的特異性[187]。除此之外，化療也能夠誘導乳腺癌細胞分泌多種EV miRNA，包括miR-9-5p、miR-195-5p和miR-203a-3p，這些miRNA同時靶向Onecut轉錄因子家族ONECUT2，導致CSC特征的誘導和干性相關基因包括NOTCH1、SOX9、NANOG、OCT4和SOX2的表達[188]。EMT也可以在TME中被EVs誘導。例如，亞油酸處理的轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231的EVs可在非致瘤性MCF10A細胞中啟動EMT樣表型轉換，增加N-cadherin、Snail1/2、Twist1/2和Vimentin表達[189]。CAF釋放的外泌體也可以使乳腺癌細胞系更高效地形成微球體，上調干性相關轉錄因子，并通過ZEB1誘導促進EMT[190]。鑒于EVs在乳腺癌進展中的重要作用，探索其作用機制可能有助于未來設計精準導向的藥物，對轉移性乳腺癌患者的預后產生積極影響。

4.4.10剛性和硬度 最近研究強調，除了來自微環境的生化線索外，物理線索也可以極大的改變細胞行為，如增殖、干細胞特性和轉移潛能。腫瘤微環境中的基質細胞可以和癌細胞協同工作，積極改變ECM的物理性質，細胞外基質的沉積、修飾和重塑增加，會產生高度纖維化的腫瘤微環境和增加的基質剛性，從而進一步促進腫瘤的進展。為了研究ECM在3D物理微環境中對CSC的影響，大多使用由殼聚糖與藻酸鹽構成的3D仿生支架或膠原涂層聚丙烯酰胺水凝膠3D Matrigel覆蓋培養系統來模擬ECM的空間結構，

目前認為ECM硬度可通過機械信號轉導調節CSC干性，隨著ECM的硬度增加，CSC的干性也逐漸增[191]。YAP/TAZ常作為細胞微環境中機械信號的傳感器和中介[192]，基質的硬度通過物理機械刺激抑制Hippo通路活化，激活YAP/TAZ促進干性和EMT。此外，Fattet等人的研究成果發現了EphA2/Lyn/Twist1信號通路，由細胞外基質的機械力激活，促進上皮-間充質轉化和細胞侵襲，高ECM剛性激活酪氨酸蛋白激酶LYN并促進EMT和侵襲，LYN直接磷酸化Twist1，促進Twist1的核定位進而促進EMT和乳腺癌轉移[193]。

5 靶向EMT和BCSCs的治療策略

BCSCs具有高度異質性和可塑性，可以迅速再生靶細胞群，對于化療或者放射治療表現出較高的耐藥性。BCSCs在E型和M型狀態下的動態平衡表明，單獨針對任何一種狀態的治療方法可能不足以消除BCSCs。一方面，攜帶EMT表型的癌細胞經過長期治療后可能轉化為耐藥細胞，另一方面，EMT可能會誘導CSCs的產生具有抗藥性。此外，EMT還可以通過血管內和外滲途徑引起癌細胞的遠處轉移。下面介紹幾種潛在的治療手段及藥物，將這些治療手段與傳統的放化療結合可以有效的靶向BCSCs和EMT。

5.1 靶向BCSC標志物治療腫瘤

靶向CSC標志物的治療方法是通過單克隆抗體特異識別和結合CSCs表面標志物，衍生出的單抗藥物、抗體偶聯藥物、納米微粒藥物等等。在侵襲性乳腺癌中，抗人CD44單克隆抗體與阿霉素和環磷酰胺聯合使用納米粒子已被用于預防腫瘤復發[194]，乳腺癌干細胞納米顆粒介導的治療也有助于化療藥物、RNAi或抗體對干細胞群體的特異性傳遞。

5.2 靶向EMT和BCSC相關異常信號通路治療腫瘤

前面已經提到有大量研究表明EMT刺激細胞干性的獲得受到多個信號通路的調節，靶向信號通路治療通常采用的方法是阻斷BCSCs異常表達的信號通路，包括Wnt、Notch、Hh、NF-κB、JAK/STAT、TGF-β/Smad、STAT3等通路，是目前開發中最龐大的一類靶向BCSCs的藥物。例如γ分泌酶抑制劑(GSIs)可以有效阻斷Notch信號通路，一項I/II期臨床試驗表明，GSI MK-0752聯合多西他賽顯著減少了CD44+/CD24-干細胞和ALDH+干細胞的數量，并降低了乳腺腫瘤中的乳腺球形成效率[195]。在體外和異種移植模型[196]中，使用Wnt信號抑制劑治療也已證實可抑制BCSCs的生長。托珠單抗可抑制IL-6/STAT3信號轉導，抑制TNBC細胞的增殖能力、遷移、侵襲能力以及EMT過程，還可以通過抑制Wnt/β-catenin乳腺癌干細胞相關通路抑制干性[134]。此外，有許多潛在的TGF-β調節劑/抑制劑如咪喹莫特[197]、貝伐珠單抗[198]都已經在臨床試驗中積極介入治療乳腺癌患者，未來的轉化研究將TGF-β抑制劑聯合其他抑制劑和化療藥物更好的靶向BCSCs，提高抑制腫瘤致瘤性和轉移的能力。

5.3 靶向表觀遺傳修飾藥物

乳腺CSCs對表觀遺傳修飾具有本質敏感性，因此可以受到基于表觀遺傳學的治療的顯著影響。DNA高甲基化抑制劑地西他濱(DAC)可通過恢復腫瘤抑制基因正常的去甲基狀態而達到治療乳腺癌的目的[199]，用納米顆粒負載低劑量的DAC(NPDAC)和阿霉素(NPDOX)可以顯著下調DNMT1和DNMT3B的表達，ALDH CSC比例顯著降低，并能較好地克服耐藥[200]。此外，DNMT抑制劑5-氮雜苷和HDAC抑制劑丁酸鹽的組合也可以顯著降低BCSCs的豐度，增加小鼠總生存率[201]。DNMTi和HDACi還可以通過表觀遺傳重編程EMT，同時靶向多個通路，具有較好的抗腫瘤作用。

5.4 靶向腫瘤微環境的乳腺癌治療

腫瘤微環境涉及的因素也調節著BCSCs的異質性和可塑性，進而影響治療耐藥。BCSCs的微環境中的各種細胞，包括免疫細胞、脂肪細胞、間充質干細胞、內皮細胞和成纖維細胞經旁分泌途徑通過細胞因子網絡與BCSCs相互作用。通過腫瘤相關巨噬細胞CSF1R的靶向抑制，可抑制TAMs活性并增強CD8+T細胞的浸潤。臨床上也正在嘗試將CSF1R小分子抑制劑和PD-1抑制劑聯合治療乳腺癌，希望協同促進腫瘤中T細胞、B細胞和NK細胞的浸潤增加，達到抑制腫瘤生長甚至防止遠處復發的目的[202]。由免疫細胞分泌的細胞因子，如IL-6、IL-8和CXCR1，已被證明在體外和異種移植模型中調節BCSCs的活性[203]。有報道指出，針對小分子CXCR1/CXCR2抑制劑repertaxin的抗體可以靶向異種移植模型中的BCSCs，從而抑制腫瘤的生長和轉移[204]。多種中藥復方或中藥提取物也被證明具有強大的臨床開發潛力，可以用于乳腺癌的治療以阻止乳腺癌轉移復發。比如天然復方大黃素可以通過阻斷TGF-β1介導的TAMs與乳腺癌細胞間的串擾，抑制乳腺癌細胞EMT和CSC的形成[142]。

5.5 靶向BCSC的免疫療法

基于免疫治療的抗BCSCs方法也受到了廣泛的研究關注，考慮到共抑制分子和免疫檢查點配體，如程序性死亡配體(PD-L1)在各種癌癥的CSCs上高度表達，許多研究小組也評估了針對BCSCs的免疫治療方法。在人類乳腺上皮細胞中誘導EMT會導致PD-L1表達上調，這主要依賴于PI3K/AKT通路的激活，并且在PD-L1表達和已知具有高EMT評分的Claudin-low乳腺癌亞群之間顯示出強關聯(P<0.000 1)[205]。與此同時，最近的一份報告還顯示，在乳腺癌中PD-L1表達和干細胞評分之間存在統計學上顯著的相關性(P<0.000 1)，PD-L1表達激活了干細胞相關基因OCT4、NANOG和Bim1的表達，并且是AKT途徑依賴的[206]。腫瘤干細胞中豐富的PD-L1表達有助于CSCs的免疫逃避，提示PD-L1可能在EMT和BCSCs相互關系中起到重要作用。上皮-間充質轉化通過EMT/β-catenin/STT3/PD-L1信號軸，在轉錄水平上通過β-catenin誘導N糖基轉移酶STT3，隨后依賴STT3的PD-L1 N糖基化穩定和上調PD-L1，從而豐富了CSCs中的PD-L1[207]。通過糖基化調控將MET與PD-L1的穩定聯系起來，并揭示了MET作為一種潛在的策略來提高癌癥免疫治療的療效。同時，基于抗體的檢查點阻斷療法可以通過破壞表達PD-L1的腫瘤細胞和表達PD-1的細胞毒性T細胞之間的相互作用來對抗腫瘤細胞，這重新點燃了沉默的宿主抗腫瘤免疫力，以消除癌細胞。

5.6 靶向代謝治療

BCSCs具有顯著不同的代謝特征，目前針對BCSCs的糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝和氧化還原代謝均開發了一系列的潛在治療藥物。BCSCs的可塑性使其能夠在增殖的E狀態和侵襲性的M狀態之間過渡，而M-和E-BCSCs依賴于不同的代謝途徑，對糖酵解和氧化還原代謝抑制劑表現出明顯不同的敏感性。Luo等[208]報道可以通過調節氧化還原信號來靶向乳腺癌干細胞的狀態平衡，糖酵解和TXN/GSH通路的共同抑制通過消除M-和E-BCSCs抑制腫瘤生長、腫瘤起始潛能和轉移，利用不同BCSCs狀態的代謝脆弱性提供了一種針對這一關鍵腫瘤細胞群的新的治療方法。

5.7 其他靶向治療方法

除了上述靶向BCSCs的治療策略外，還提出了一些其他的治療策略，如天然化合物提取物、miRNA抑制相關癌基因、二甲雙胍治療、納米顆粒靶向治療、透明質酸綴合包裹策略等等。利用納米顆粒靶向miRNAs并將siRNA傳遞到腫瘤是逆轉耐藥和提高療效的有效策略，如miR-124通過靶向STAT3控制HIF-1信號通路，逆轉BCSCs對阿霉素的耐藥[209]。低劑量的二甲雙胍可以選擇性殺死BCSCs，采用透明質酸植入二甲雙胍負載氧化石墨烯(HA-GO-Met)納米顆粒更好的提高抗癌效果[210]。透明質酸綴合包裹化療藥吉西他濱形成的脂質體復合物也可以通過穩定吉西他濱并增強其對BCSCs的靶向識別來特異性地殺傷乳腺癌干細胞，以達到對乳腺癌精準治療的目的。

6 總結和展望

大量研究證實了干性和EMT的關系的確是錯綜復雜的：EMT和干性存在高度相關性,大量研究顯示經歷EMT的細胞具有干細胞特性，具有干性的腫瘤細胞也表達EMT標記;乳腺癌干細胞具有高度異質性和可塑性，賦予癌細胞在不同狀態之間動態轉化的能力,乳腺癌干細胞同時受益于這兩種特性提供的優勢，表現出更高的轉移能力和抵抗不同治療方式的能力;在腫瘤細胞中誘導EMT不僅促進干性，腫瘤細胞侵襲和轉移，而且還有助于耐藥性，BCSCs成為促進EMT過程的主要參與者;EMT通過改變乳腺癌細胞的基因表達譜，調控與干性相關基因的表達，從而促進乳腺癌復發、轉移和耐藥;TGF-β、Wnt、Notch、Hippo、NF-κB、Hh和IL-6/STAT3等多條信號轉導通路通過調控大量轉錄因子、表觀因子調節調控EMT和干性;腫瘤微環境中包含的免疫細胞、基質細胞、細胞因子和生長因子、細胞外基質等多種因素以及存在的顯著低氧、酸性等生理特點也可以調節EMT、MET、腫瘤干細胞的產生，從而影響腫瘤組織的惡性進展。

但是，EMT和干性的本質聯系是什么？EMT是否一定增加干性？干性增加是否一定促進EMT？部分EMT是如何被調控的？EMT誘導的乳腺癌干細胞形成機制在多大程度上可推廣到其他組織和腫瘤類型？靶向EMT和干性的藥物還沒有真正上市等等一系列問題仍然懸而未決。

鑒定出調控乳腺癌干細胞EMT的關鍵環境因子、信號通路、轉錄因子和表觀因子；闡明正常生理及病理條件下EMT/MET調控乳腺發育和乳腺癌發生發展過程中干細胞的功能及其分子機制，為乳腺癌防治提供新的靶點和策略；將生物信息學和組學研究結合，基于“疾病-基因-靶點-藥物”的策略，探尋靶向BCSCs的小分子藥物，這些都是未來將要努力的方向。此外，對乳腺癌干細胞和上皮間質轉化的進一步研究需要利用更多的技術進行可視化，更好地表征他們的表型，利用強有力的生物標記物以及基因和信號通路，確定新的治療方法及潛在靶點，以防止轉移和復發，并改善臨床結果。

致謝本論文得到國家科技部重點研發計劃項目(2020YFA0112300)、國家自然科學基金 (81830087, U2102203, 82173014)和云南省科技廳重點項目(202101AS070050)資助。