應用網絡藥理學結合分子對接技術探討四神煎對膝骨關節炎和類風濕性關節炎的“異病同治”機制

鐘賢興， 安鎮南， 高豐禾， 吳春飛， 范帥， 梁祖建

（1.廣州中醫藥大學第三臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東廣州 510240）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）和類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）都是骨傷科、風濕免疫科常見的關節疾病。2種疾病的發病特征均具有病因復雜、病癥多樣化、病程遷延等特點，臨床表現多為關節疼痛、腫脹、畸形、活動受限，嚴重影響患者的生活質量[1]。骨關節炎（osteoarthritis，OA）是累及整個關節的慢性退行性疾病，而KOA在臨床最常見，主要表現為膝關節疼痛與活動受限[2]。RA是以關節滑膜炎、炎性骨破壞為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，臨床表現為全身多發骨關節病變、關節畸形、晨僵等[3]。現階段，KOA和RA的治療仍缺乏特效藥物及方法，臨床療效仍不理想。隨著中醫藥研究的不斷發展，中醫藥在治療KOA、RA方面顯現出多靶點干預與安全有效的獨特優勢，具有深厚的臨床實踐基礎。

四神煎出自清代鮑相璈《驗方新編》“病在筋則伸不能屈，在骨則移動多艱，久則日粗日腫，大腿日細，痛而無膿，顏色不變，成敗癥矣，立方四神煎。”方中：重用黃芪為君，匡扶正氣以蠲痹除滯；牛膝強健筋骨，通利關節，尤善治膝關節屈伸不利；金銀花清熱解毒，消瘀化熱，治療關節腫痛；遠志可祛痰消腫；石斛可養陰生津。該方用藥雖僅5味，但組方嚴謹，既補已損之氣陰，又驅除經絡之郁邪，補而不滯，清而不寒；藥簡而量大，功專而效宏。近代著名中醫家岳美中先生盛贊此方為治療膝痹的專病專方，其言“鶴膝風，膝關節紅腫疼痛步履維艱，投以《驗方新編》四神煎恒效”“歷年來余與同人用此方治此病，每隨治隨效，難以枚舉”。隨著四神煎應用范圍的擴大，臨床報道可見醫家用其治療RA、膝關節滑膜炎、強直性脊柱炎、糖尿病周圍神經病變[4]，療效顯著，凸顯了中醫藥異病同治的獨特優勢。但中藥成分復雜，關于四神煎的物質基礎及其治療KOA及RA的作用機制仍未闡明。故本研究基于網絡藥理學“整體觀”的研究方法，構建“疾病-通路-靶點-藥物”的多級網絡，從多角度分析并闡述四神煎組方中藥的主要活性成分和KOA、RA的關聯性，以期進一步拓展四神煎異病同治的科學內涵，為臨床推廣應用和深入研究提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1藥物有效活性成分及靶點的篩選應用TCMSP數據庫（http://herb.ac.cn/）檢索黃芪、牛膝、遠志、石斛、金銀花的化學成分，根據檢索結果，按ADME原則[口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，藥物半衰期（half-life，HL）≥4]進行篩選，獲得其活性成分，并預測其對應靶點。將篩選所得所有靶蛋白名稱導入UniProt數據庫（https://www.uniprot.org），設置物種為人類（Homo sapiens），對得到的靶蛋白進行比對和基因名校正，轉換成標準的基因名，并刪除無對應基因名的靶蛋白。對未檢索到的中藥“石斛”“遠志”，分別從BATM-TCM數據庫、HERB數據庫（http://herb.ac.cn/）檢索相關化學成分，并通過文獻檢索對所有藥物的有效活性成分進行完善，然后通過PubChem數據庫獲取化合物的2D結構，導入SwissADME得到其SMILES。同樣根據ADME原則進行篩選，對篩選出的化合物通過SwissTargetPrediction數據庫進行預測，獲取其對應靶點。

1.2藥效成分-靶點互作網絡構建利用Cytoscape 3.7.2軟件構建四神煎-有效活性成分-靶點互作網絡。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Networkanalyze”功能進行網絡拓撲學分析，篩選得出核心活性成分及潛在靶基因。

1.3疾病靶點獲取通過Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫分別檢索“Knee Osteoarthritis”“Rheumatoid Arthritis”，得到KOA、RA相關疾病靶點，并將3個數據庫所得靶點分別合并、去重，再利用Uniprot數據庫匹配已驗證的人類靶點基因名。

1.4活性成分與疾病的共同靶點篩選及PPI網絡構建明確KOA、RA相關靶點與藥物潛在靶點之間的相互作用，應用R語言（https://www.r-project.org/）軟件及Perl語言程序將疾病靶點與藥物靶點進行交集，并輸入Venny 2.1軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖。應用STRING數據庫（https://string-db.org/）分別構建共同靶點互作網絡（protein-protein interaction，PPI），將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將Settings設為“high confidence：0.9”，并隱藏無關系的靶點，其他參數保持默認設置，獲得PPI網絡。應用Count.R插件獲得共同蛋白靶點出現的頻次。進一步通過Cytoscape 3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）得到潛在靶基因的PPI網絡模型，對PPI網絡進行拓撲分析以篩選關鍵靶點。

1.5疾病-方藥-成分-靶點互作網絡構建通過Cytoscape 3.7.2軟件構建疾病-方藥-成分-靶點互作網絡，以探究藥物的潛在藥理學作用機制。網絡圖中“node”代表方藥、疾病、活性成分和靶點，“edge”代表活性疾病-方藥-成分-靶點之間的相互關系。

1.6基因本體論（GO）生物功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集應用R語言（https://www.r-project.org/）軟件中clusterProfilerGO.R包及Perl語言對活性成分與KOA、RA的共同靶點分別進行GO分析。GO分析主要用于描述基因產物的功能，其中包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學過程（biological process，BP）。并應用clusterProfilerKEGG.R包進行KEGG通路富集分析，同時，利用pathview包繪制相應的信號通路圖。根據富集因子值分析核心通路富集程度，探究四神煎治療KOA、RA可能的生物功能及信號通路機制。

1.7分子對接驗證為探究前期網絡藥理學篩選的按照度值排列前4位的有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與KOA、RA相關核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8之間的互作關系，對二者進行分子對接驗證。從PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載有效活性成分的結構式，利用Chem 3D軟件制作相應的3D結構，并輸出為mol*2格式，再從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載核心蛋白結構域的pdb格式，利用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、去磷酸根等操作。利用AutoDockTools 1.5.6軟件將藥物活性成分及核心蛋白基因文件pdb格式轉換為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運行Vina腳本進行分子結合能計算以及分子對接結果展示。同時運行Discovery Studio（DS）2019尋找對接位點并計算柔性結合的LibDockScore，將輸出的分子對接結果導入PyMOL軟件進行分子對接構象展示。若結合能小于0說明配體與受體可自發結合，當Vina結合能≤-5.0 kcal·mol-1以及LibDockScore＞100，說明兩者形成穩定對接。對配體-受體復合物進行分子對接結果3D展示，以評價生物信息分析預測的可靠性。

2 結果

2.1藥物有效成分和對應靶點及其互作網絡構建通過TCMSP數據庫、BATM-TCM數據庫、HERB數據庫（http://herb.ac.cn/）以及文獻檢索，經ADME原則篩選后獲得四神煎有效成分67種，其中共有成分4種。黃芪、金銀花、牛膝、石斛、遠志有效成分分別為16、17、18、11、11種，黃芪、金銀花、牛膝共有成分2種，金銀花、牛膝共有成分2種。結合SwissTargetPrediction，得到藥物靶點230個。采用Cytoscape 3.7.2軟件構建四神煎-有效活性成分-靶點互作網絡，共獲得303個節點（其中靶點156個，活性成分67個），1 000條邊，結果見圖1。

圖1 四神煎-有效活性成分-靶點互作網絡Figure 1 Sishen Jian-active component-target interaction network

2.2疾病靶點篩選通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數據庫分別得到KOA、RA的相關靶點2 116、5 088個，分別去重后，共獲得KOA疾病靶點2 110個，RA疾病靶點5 058個。

2.3共同靶點篩選及互作網絡構建得到的230個四神煎藥物活性成分靶點與2 110個KOA相關疾病靶點、5 058個RA疾病相關靶點分別導入在線韋恩圖制作網站InteractiVenn，相匹配映射得到中藥治療KOA的潛在作用靶點115個，治療RA的潛在作用靶點147個。將治療KOA、RA的潛在靶基因導入STRING在線分析網站（https://string-db.org/），設置隱藏未連接的靶點，設定最低互作評分中的“highest confidence>0.900”，并導出PPI結果數據。進一步通過Cytoscape 3.7.2軟件分別得到治療KOA、RA潛在靶基因的PPI網絡模型，運用其中的cytoHubba插件篩選Hub基因，使用Degree算法，得出排名前20位的潛在核心靶基因，通過CytoNCA插件分析網絡并限定Degree、BC、CC、NC、LAC值均大于等于中位數，得到PPI核心網絡，結果見圖2。

圖2 四神煎治療膝骨關節炎（KOA）、類風濕性關節炎（RA）的PPI核心網絡Figure 2 PPI core network of Sishen Jian in treating KOA and RA

2.4疾病-方藥-成分-靶點互作網絡構建互作網絡構建采用Cytoscape 3.7.2軟件在構建KOA/RA-四神煎-成分-靶點互作網絡，共獲得214個節點（其中靶點156個，活性成分55個），909條邊，結果見圖3。

圖3 膝骨關節炎（KOA）/類風濕性關節炎（RA）-四神煎-成分-靶點互作網絡Figure 3 Interaction network of KOA/RA-Sishen Jian-component-target

2.5藥物治療KOA、RA的生物功能（GO）分析及核心通路篩選運用R語言中的Bioconductor包、clusterProfiler包分別對中藥治療KOA的115個潛在作用靶點、治療RA的147個潛在作用靶點進行GO和KEGG通路富集分析，結果顯示：治療KOA的115個潛在靶基因GO分析可見其主要富集于DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、內肽酶活性等；治療RA的147個潛在作用靶點GO分析可見其主要富集于DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素樣白連接酶結合等。見圖4。而KOA的潛在作用靶點KEGG通路富集分析發現其主要集中于脂質和動脈粥樣硬化、化學致癌作用-受體激活、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路、TNF信號通路，RA的潛在作用靶點KEGG通路富集分析發現其主要集中于脂質和動脈粥樣硬化、化學致癌作用-受體激活、PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、MAPK信號通路，見圖5。

圖4 GO功能分析氣泡圖Figure 4 Bubble diagram of GO function analysis

注：A.膝骨關節炎（KOA）；B.類風濕性關節炎（RA）

2.6分子對接結果表1結果顯示：槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8形成穩定對接，其結合能均低于-5.0 kcal·mol-1（其中石斛苷F與蛋白MAPK14結合能大于-5.0 kcal·mol-1）。有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F分別與核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8的受體-配體進行柔性對接，結果顯示，DS軟件均能找到對接位點且MAPK14與槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F形成的對接模型LibDockScore均大于100，其余均小于100。綜合分析發現，核心蛋白MAPK14與山柰酚，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素形成最穩定的對接模型。由于蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8與不同活性成分在不同氨基酸位點形成不同的氫鍵及疏水鍵聯系，因此彼此，形成不一樣的對接體。最后，利用Vina輸出的化合物結果導入Pymol中以及利用Discovery Studio 2019軟件，與蛋白配體進行三維分子對接展示，見圖6。

圖6 分子對接3D模型Figure 6 3D model of molecular docking

表1 分子對接Vina、Discovery Studio 2019結果Table 1 Molecular docking results of Vina and discovery studio 2019

3 討論

“異病同治”源于《黃帝內經》，確立于《傷寒雜病論》，至今仍指導著中醫臨床診斷及治療。根據KOA、RA的臨床表現，當歸屬于中醫學之“骨痹”“尪痹”的范疇，其主要病因病機為素體虧虛，復加外感風、寒、濕、熱之邪而致經脈阻塞、氣血不暢，氣血痰濕壅滯于關節，導致關節腫脹疼痛[5]。相關研究表明，OA與RA可能存在共同發病的機制，且受共同的因子調節（如TC蛋白、線粒體等）[6-8]。另外，最近研究發現，褪黑素可能通過調節晝夜節律進而緩解關節炎癥反應[9]。基于此，KOA與RA的中醫證候和西醫發病機制均有共通點，采用相同方藥進行治療有其理論依據與現實意義，本研究采用網絡藥理學和分子對接對其進行分析和驗證。

本研究基于網絡藥理學，篩選出67種四神煎藥物活性成分，共預測獲得四神煎治療KOA的潛在作用靶點115個，治療RA的潛在作用靶點147個，經共有靶點PPI網絡構建，結合網絡拓撲分析方法篩選出關鍵靶點和核心網絡，最終獲得四神煎治療KOA的關鍵靶點有：MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6、VEGFA、IGF2；治療RA的關鍵靶點有：RELA、EGFR、MAPK8、CCND1、IL6、FOS、MAPK14、CTNNB1。其 中MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6是四神煎治療2種疾病共有的關鍵靶點。MAPK8和MAPK14屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，MAPK主要涉及癌癥和炎癥類疾病。目前，關于MAPK和RA的研究較為充分，MAPK不僅能調節促炎細胞因子在關節組織中的產生，而且在IL-1、IL-17和TNF-α受體下游的信號級聯中發揮重要作用[10]。JNK MAPKs還能通過基質金屬蛋白酶（MMP）介導的軟骨破壞導致RA的發生[11]，p38MAPK可調節IL-17信號轉導途徑，以及促炎細胞因子和介質的釋放[12]。EGFR同樣在RA的發病中發揮重要作用，研究顯示，EGFR信號的激活是RA中滑膜成纖維細胞增殖的原因。EGFR及其配體還可以在RA發病機制期間誘導滑膜成纖維細胞的細胞因子產生[13]。此外，還有研究發現，RA與血清EGFR蛋白的水平升高有關[14]。CCND1屬于細胞周期蛋白家族，CCND1是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，Wnt通路在RA的發病機制中起著重要作用，該信號通路的激活可導致滑膜細胞增殖，促進滑膜增生，導致骨損傷，破壞關節功能[15]。同時，Wnt通路還可以通過調節成骨細胞和破骨細胞的平衡來調節骨形成[16]。IL-6參與的炎癥途徑也是RA發生和進展的部分原因，IL-6在破骨細胞介導的骨吸收中起著至關重要的作用，這些過程有助于IgM和IgG類風濕因子以及瓜氨酸肽抗體的產生，瓜氨酸肽抗體在RA中特征性增加[17]。靶向IL-6治療RA已被證明是有效的，多種IL-6靶向藥物已應用于臨床或處于研發階段[18]。綜上可知，這些關鍵靶點與KOA和RA的發生發展密切相關。

GO富集分析結果顯示，四神煎對KOA的作用靶點主要通過調節DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、內肽酶活性等過程，對RA的作用靶點主要涉及DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合等過程。

KEGG通路分析結果顯示，四神煎治療KOA的潛在作用靶點主要富集于TNF信號通路。該通路是參與全身炎癥反應的重要通路之一，TNF信號通路的關鍵分子TNF-α在關節細胞的代謝調節中是主要參與者[19]。文獻研究結果顯示，TNF-α與KOA、RA疾病的進展密切相關，TNF-α對于KOA、RA具有重要的疾病預測價值[20-22]。四神煎治療RA的潛在作用靶點主要富集于PI3K/AKT信號通路。文獻顯示，PI3K/AKT通路在軟骨細胞增殖、凋亡和基質重塑中起重要作用，與KOA的發生有密切聯系[23]。PI3K/AKT信號通路不僅參與滑膜成纖維細胞的異常增殖和滑膜炎癥，還影響破骨細胞的分化和生成。破骨細胞通過PI3K/AKT信號通路遷移、破壞骨骼和關節軟骨，最終導致關節畸形，加重RA的發展[24-25]。

本研究根據“疾病-方藥-成分-靶點”網絡分析得到前4個核心活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與核心靶點MAPK14、EGFR、MAPK8進行結合能力預測。分子對接結果顯示，核心蛋白MAPK14與山柰酚，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素形成最穩定的對接模型。槲皮素是一種天然抗氧化劑，具有淬滅自由基保護細胞免受損害的作用[26]。研究顯示，槲皮素具有抗關節炎的作用，其機制可能涉及抑制氧化應激、細胞因子和COX-2的產生、蛋白多糖的降解以及多個相關信號通路的激活[27]。山柰酚是一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用，其可通過下調miR-146a激活PI3K/AKT信號通路，抑制促炎因子的釋放，發揮抗骨關節炎的作用[28]。石斛苷G和石斛苷F屬于萜類成分，就目前研究來看，尚缺乏這2種成分抗關節炎的藥理學機制研究，本研究也為將來石斛苷G和石斛苷F抗關節炎的機制研究提供了參考。

綜上所述，四神煎中存在槲皮素、山柰酚、石斛苷G、石斛苷F等活性成分，這些成分可作用于MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6等靶點對KOA和RA進行干預，其主要機制可能涉及TNF信號通路、PI3K/AKT通路等。同時，關鍵活性成分與關鍵靶點能形成較為穩定的對接模型，這為四神煎的臨床應用及后續實驗研究提供了參考依據。另外，本研究尚存在一些局限性：首先，本研究是建立在“成分-靶標-疾病”網絡的分析，僅限于對四神煎整體機制的預測，仍無法確定不同配比、人體代謝前后組分中藥含量、成分種類差異等；其次，由于篩選條件限制，研究中分析的是四神煎的主要成分及靶點，或許不能全面覆蓋具有實質作用的成分；最后，基于網絡藥理學雖能獲得大量靶點與機制，但國內相關動物實驗研究較少，仍需結合實驗進一步驗證。