紫草素對鼻咽癌CNE1細胞免疫逃逸的影響

王祥香， 吳李仲， 吳祥基

（瓊海市人民醫院耳鼻喉科，海南瓊海 571400）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是指原發于鼻咽黏膜被覆上皮的惡性腫瘤，發病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首，患者臨床主要表現為回縮性血涕、鼻出血等，隨著疾病發展可累及聽力受損和吞咽障礙等[1]。鼻咽癌屬于中醫學“鼻淵”“鼻疽”“鼻衄”“石上疽”等范疇，肺熱痰火及肝膽熱毒上擾為鼻咽癌發病的主要病機[2]。近年來，從中草藥中提取有效的活性成分逐步成為化療藥物研究的熱點。紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內蒙紫草Arnebia guttataBunge的干燥根，味甘、咸，性寒，歸心、肝經，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等病證。紫草素（shikonin）是從紫草中提取的小分子萘醌類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多重藥理作用[3]。已有研究表明，紫草素具有顯著抗鼻咽癌的作用[4-6]，并能改善腫瘤細胞耐藥[7-8]，但其具體作用機制尚不完全明確。腫瘤免疫逃逸是腫瘤形成的關鍵，也是腫瘤免疫治療的重要突破口[9]。因此，本研究擬通過體內外實驗，觀察紫草素對鼻咽癌免疫逃逸的影響，進一步探討紫草素的抗鼻咽癌作用，以期為臨床治療鼻咽癌提供參考依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞來源及培養人鼻咽癌CNE1細胞，購自美國菌種保存中心（ATCC）。CNE1細胞以含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基在37℃、體積分數5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養，每隔1 d更換培養液，生長到90%時，取處于對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2藥物、試劑與儀器紫草素（分子式：C16H16O5；分子量：288.3；純度＞99%），美國Sigma公司生產，批號：S7576；紫杉醇（純度≥98%），云南漢德生物技術有限公司生產，批號：cp110302。胎牛血清、RPMI 1640培養基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；兔抗GAPDH抗體（美國Abcam公司）；兔抗程序性死亡受體1配體（PD-L1）抗體、兔抗叉頭樣轉錄因子3（Foxp3）抗體、兔抗維甲酸相關孤核受體γt（RORγt）抗體（美國BD Pharmingen公司）；山羊抗兔IgG（武漢純度生物科技公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（上海研謹生物科技公司）。流式細胞儀（天津眾立生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（上海豫光儀器公司）；凝膠成像系統及Western Blot電泳系統（北京賽百奧科技公司）；SpectraMax iD5多功能酶標儀（北京普凱瑞生物科技有限公司）。

1.3體外研究

1.3.1 紫草素配制 紫草素溶解于1%二甲基亞砜（DMSO），配制成64 μmol/L溶液，-20℃保存，實驗時用RPMI 1640培養基稀釋到所需濃度。

1.3.2 分組與干預 人鼻咽癌CNE1細胞重懸后，以1.5×106個/mL接種于96孔板中，分為陰性對照組，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組。陰性對照組CNE1細胞不進行干預；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組CNE1細胞分別給予對應濃度紫草素共同培養；紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細胞與2.5 μmol/L的紫杉醇共同培養。均處理24 h。

1.3.3 MTT法測定CNE1細胞活性 將CNE1細胞密度調成5×103個/mL，接種于6孔板中培養，按“1.4”項進行分組與干預，24、48、72、96 h后，按照MTT試劑盒說明書步驟進行操作，最后應用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度（OD）值。每組設置3個復孔，實驗重復2次。

1.3.4 Hoechst法檢測CNE1細胞凋亡情況 將CNE1細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞，按“1.4”項進行分組與干預。用40 g/L的多聚甲醛溶液固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入5 mg/L Hoechst熒光材料染色，在細胞培養箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞呈高亮藍色熒光，未凋亡細胞呈低強度熒光。隨機拍照選擇5個高倍鏡視野，應用ImageJ 1.47i軟件分析平均熒光強度。實驗重復5次。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測CNE1細胞Foxp3、RORγt蛋白表達 將CNE1細胞接種于6孔板中，細胞密度為2.5×104個/mL，按“1.4”項進行分組與干預。裂解、離心取上清，BCA法進行蛋白定量，上樣、電泳后，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，先后與一抗二抗反應[Foxp3（1∶600稀釋）、RORγt（1∶1 000稀釋）和內參GAPDH（1∶2 000稀釋）等一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）常溫孵育2 h]，加入電化學發光試劑（ECL）顯色，曝光，最后應用JY-Clear系統分析各蛋白灰度值，結果以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值表示。

1.4體內研究

1.4.1 鼻咽癌裸鼠模型建立 取對數分裂期CNE1細胞備用。取48只健康雄性BALB/c裸鼠，體質量18~22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0006。動物實驗按照《實驗動物管理條例》規定進行。參考文獻方法[5]建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型：無菌環境下于裸鼠側背部皮下注射1.0×107個/mL單CNE1細胞懸液，10 d后出現綠豆大小的腫瘤塊。接種21 d時腫瘤體積在100 mm3以上表示建模成功。

1.4.2 裸鼠分組及干預方法 建模成功后，將鼻咽癌模型裸鼠分為模型組，紫草素低、中、高劑量組和紫杉醇組，另設正常組，每組8只。紫草素低、中、高劑量組裸鼠分別灌胃1.0、2.0、3.0 mg/kg紫草素，紫杉醇組裸鼠腹腔注射2.0 mg/kg紫杉醇，正常組和模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液。每日1次，連續7 d。

1.4.3 巨噬細胞分離、培養 末次干預后頸部脫臼法處死裸鼠，75%乙醇消毒后放入超凈工作臺中用不含血清的RPMI 1640培養液腹腔灌洗3次。收集灌洗液以10 000 r/min（離心半徑12 cm）離心10 min，收集細胞并進行計數。重懸細胞后接種于6孔板中，放入5%CO237℃孵箱內培養，2 h后棄掉培養液，PBS沖洗2次，再次加入含有10%PBS的RPMI 1640培養基，繼續培養24 h。

1.4.4 流式細胞術檢測各組巨噬細胞中PD-L1的表達 巨噬細胞培養24 h后，細胞吹打后以2 000 r/min離心（離心半徑10 cm）。用PBS重懸細胞，加入PD-L1抗體，5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）結合物與5 μL碘化丙啶（PI）混合后染色，避光條件下，孵育15 min后注入400 μL結合緩沖液混勻。洗滌3次，上流式細胞儀檢測。應用FlowJo 7.6軟件進行數據分析。

1.4.5 瘤體質量及抑瘤率 頸部脫臼處死裸鼠，剝離瘤體并稱質量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組腫瘤質量-治療組腫瘤質量）/模型組腫瘤質量×100%。

1.4.6 Western Blot法檢測Foxp3、RORγt蛋白表達 取正常組鼻黏膜組織及其他各組腫瘤組織，關鍵檢測步驟同“1.3.5”項。

1.5統計方法采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組CNE1細胞活性比較表1結果顯示：干預24、48、72、96 h時，與陰性對照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細胞活性均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），呈時間和劑量依賴性。結果表明，紫草素可以抑制鼻咽癌CNE1細胞增殖。

表1 各組CNE1細胞活性比較Table 1 Comparison of CNE1 cell activity among various groups

2.2各組CNE1細胞凋亡率比較結果顯示：陰性對照組，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組的CNE1細胞凋亡率分別為（2.25±0.15）%、（12.14±0.30）%、（18.50±1.20）%、（24.55±2.25）%及（26.33±2.47）%，多組間比較存在差異（F=228.400，P＜0.001）。與陰性對照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組及紫杉醇2.5 μmol/L組CNE1細胞凋亡率升高（P＜0.05）；紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組間細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L組細胞凋亡率與紫杉醇2.5 μmol/L組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。如圖1所示，Hoechst染色凋亡細胞核呈亮藍色，呈現分葉、碎片狀，表明紫草素可以促進鼻咽癌CNE1細胞凋亡，起到抗腫瘤作用。

圖1 Hoechst法檢測各組CNE1細胞凋亡結果Figure 1 Results of the Hoechst method for detecting apoptosis of CNE1 cells in various groups

2.3各組CNE1細胞Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較表2結果顯示：與陰性對照組比較，紫草素1.2、2.4、3.6 μmol/L組 及 紫 杉 醇2.5 μmol/L組CNE1細胞中Foxp3蛋白表達水平升高、RORγt蛋白表達水平降低（P＜0.05）；紫草素3.6 μmol/L組組Foxp3、RORγt蛋白表達水平與紫杉醇2.5 μmol/L比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白電泳結果如圖2所示。

圖2 各組CNE1細胞Foxp3、RORγt蛋白電泳圖Figure 2 Electropherogram of Foxp3 and RORγt proteins in various groups of CNE1 cells

表2 各組CNE1細胞Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較Table 2 Comparison of protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of CNE1 cells

2.4各組裸鼠巨噬細胞中PD-L1表達比較正常組、模型組、紫草素低劑量組、紫草素中劑量組、紫草素高劑量組及紫杉醇組PD-L1在裸鼠巨噬細胞表達的陽性率分別為（4.50±0.26）%、（55.82±2.50）%、（39.86±2.11）%、（30.43±1.80）%、（18.93±1.37）%及（17.24±1.05）%，多組間比較存在顯著性差異（F=118.000，P＜0.001）。與陰性對照組比較，模型組裸鼠巨噬細胞中PD-L1表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠巨噬細胞中PD-L1表達水平均降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間巨噬細胞中PD-L1表達水平比較，存在顯著性差異（P＜0.05）；紫草素高劑量組PD-L1表達水平與紫杉醇組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組裸鼠巨噬細胞PD-L1表達的流式細胞術結果如圖3所示。

圖3 流式細胞術檢測各組裸鼠巨噬細胞中PD-L1表達結果Figure 3 Flow cytometry results of PD-L1 expression in macrophages in various groups of nude mice

2.5各組裸鼠瘤體質量及抑瘤率比較表3結果顯示：與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠瘤體質量均降低，抑瘤率升高（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間瘤體質量及抑瘤率比較存在差異（P＜0.05）；紫草素高劑量組瘤體質量及抑瘤率與紫杉醇組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組裸鼠移植瘤大體形態如圖4所示。

圖4 各組裸鼠移植瘤大體形態Figure 4 Gross morphology of transplanted tumours in various groups of nude mice

表3 各組裸鼠瘤體質量及抑瘤率比較Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

表3 各組裸鼠瘤體質量及抑瘤率比較Table 3 Comparison of tumour mass and tumour inhibition rate among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與紫草素低劑量組比較；③P＜0.05，與紫草素中劑量組比較

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2.6各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較表4結果顯示：與正常組鼻黏膜組織比較，模型組裸鼠腫瘤組織Foxp3蛋白表達水平降低、RORγt蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組及紫杉醇組裸鼠腫瘤組織Foxp3蛋白表達水平升高、RORγt蛋白表達水平降低（P＜0.05）；紫草素低、中、高劑量組間Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；紫草素高劑量組Foxp3、RORγt蛋白表達水平與紫杉醇組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Foxp3、RORγt蛋白電泳結果如圖5所示。

圖5 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白電泳圖Figure 5 Protein electropherogram of Foxp3 and RORγt in various groups of nude mice

表4 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

表4 各組裸鼠Foxp3、RORγt蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of Foxp3 and RORγt among various groups of nude mice （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與紫草素低劑量組比較；④P＜0.05，與紫草素中劑量組比較

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3 討論

腫瘤微環境中的免疫抑制狀態被認為是腫瘤發生和快速發展的主要原因。大量腫瘤相關巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫抑制細胞構成了免疫抑制的微環境，在腫瘤逃逸機體免疫應答中發揮了重要的作用。有研究[10]證實，腫瘤相關巨噬細胞表達程序性死亡受體1配體（PD-L1）后腫瘤微環境處于免疫抑制狀態。PD-L1屬于B7家族的細胞表面糖蛋白，高表達PD-L1的腫瘤相關巨噬細胞主要通過與CD8+T淋巴細胞上的程序性死亡受體1（PD-1）結合介導免疫調節，抑制效應T細胞的增殖、存活，發揮負向調控T細胞活性的作用，并介導其發生凋亡，導致殺傷腫瘤的淋巴細胞數量減少，削弱免疫系統的抗腫瘤效應[11]，但PD-L1+巨噬細胞在鼻咽癌進展過程中的作用尚未明確。本研究通過建立荷鼻咽癌CNE1細胞裸鼠移植瘤模型，采用不同濃度的紫草素干預后提取巨噬細胞，結果顯示：紫草素可以下調巨噬細胞中PD-L1的表達，減小瘤體體積，表明紫草素可抑制巨噬細胞PD-L1表達，減少腫瘤細胞免疫逃逸，從而抑制鼻咽癌細胞增殖。

輔助性T細胞17（Th17）與T調節細胞（Tregs）均為CD4+T細胞亞群之一，通過分化與功能的相互拮抗，共同維持機體免疫功能的相對穩定。RORγt是對Th17細胞的分化起關鍵作用的轉錄因子，若抑制RORγt的表達，則可抑制未致敏T細胞向Th17細胞分化[12]。研究表明，由炎癥反應導致腫瘤細胞中也存在RORγt表達激活[13]。Foxp3被認為是Treg細胞的關鍵轉錄因子和特異性標記物，它可通過與染色體結合后，調節多種基因的表達和功能，進而控制Treg細胞的發育[14]。在腫瘤發展過程中，Foxp3降低可促進免疫逃逸[15]。研究表明，鼻咽癌細胞Foxp3活性下降，干預后Foxp3表達升高而發揮抑制腫瘤的作用[16]。轉錄因子RORγt和Foxp3決定細胞受抗原刺激后是向Th17細胞分化還是向Treg細胞分化的情況，兩者的平衡或紊亂決定了機體的免疫狀態。本研究結果顯示，在鼻咽癌細胞或鼻咽癌裸鼠中均存在Foxp3表達降低、RORγt表達升高，采用紫草素干預后腫瘤細胞Foxp3表達升高，RORγt表達降低，表明紫草素可以上調鼻咽癌Foxp3水平、下調RORγt水平，進而調節鼻咽癌腫瘤微環境中Treg主導的免疫耐受現象。

綜上所述，紫草素可以抑制鼻咽癌細胞增殖，抑制瘤體生長，其機制可能與其降低腫瘤微環境巨噬細胞的PD-L1活性，激活腫瘤細胞Foxp3并抑制RORγt表達，進而減少腫瘤細胞免疫逃逸有關。