清燥救肺湯含藥血清對非小細胞肺癌細胞惡性行為的影響

張美英， 侯煒， 高坤

（1.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053；2.中國中醫科學院望京醫院，北京 100053）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是指源于支氣管黏膜上皮或者肺泡上皮的惡性腫瘤，是肺癌最常見的類型。隨著中醫藥學的發展，中醫在治療肺癌方面取得了顯著的成果。肺癌歸屬于中醫學“肺痿”的范疇，燥熱傷肺是肺癌的重要病機[1]。清燥救肺湯具有清燥潤肺、益氣養陰的功效，既往臨床和實驗研究表明，清燥救肺湯對肺癌有顯著的療效[2-5]，但關于其具體作用機制仍不明確，因此，本研究以NSCLC細胞株H1299為研究對象，進一步觀察清燥救肺湯抗肺癌機制，以期為臨床治療提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗細胞與動物人非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株H1299，購自北京科瑞思搏生物科技有限公司。24只SPF級8周齡雄性SD大鼠，體質量180~200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物實驗于中國中醫科學院廣安門醫院實驗室[動物使用許可證號：SYXK（京）2014-0041]完成。實驗方案經中國中醫科學院廣安門醫院倫理委員會批準（批準號：2016-052-KY）。按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2試劑與儀器干擾素γ（IFN-γ）抗體、白細胞介素4（IL-4）抗體、胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）抗體、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）抗體，購自沈陽萬類生物科技公司；RPMI 1640培養基，購自上海善然生物科技公司；Transwell小室，購自上海生博生物醫藥公司。蛋白電泳儀，購自北京科普爾科技公司；PCR儀，購自蘇州雅睿生物公司；高速離心機，購自武漢益普生物科技公司。

1.3藥物及制備清燥救肺湯組成：桑葉（霜）9 g，炙甘草3 g，麥冬10 g，枇杷葉9 g，生石膏12 g，黨參12 g，阿膠9 g，苦杏仁9 g。所有中藥材購自中國中醫科學院廣安門醫院中藥局。常規煎煮后，濃縮生藥含量1 g/mL，冷卻后4℃保存備用。

1.4含藥血清制備適應性喂養2周后，將24只大鼠隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組12只，含藥血清組大鼠給予清燥救肺湯5.5 g/kg灌胃，空白血清組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，干預2周[3]。末次灌胃后經大鼠尾部采血，離心，保留血清，56℃水浴滅活，除菌過濾后，-20℃密封冷藏備用。

1.5含藥血清干預及分組取第3代NSCLC細胞株H1299，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后以1×106個/孔接種于6孔板，37℃、CO2培養箱中培養，細胞貼壁后更換新鮮的無血清RPMI 1640培養基繼續培養。培養1 d后，棄上清。實驗分為空白血清組及清燥救肺湯低、中、高濃度含藥血清組（簡稱清燥救肺湯低、中、高濃度組）?？瞻籽褰M：NSCLC細胞+10%空白血清培養；清燥救肺湯低濃度組：NSCLC細胞+2.5%清燥救肺湯含藥血清+7.5%空白血清；清燥救肺湯中濃度組：NSCLC細胞+5%清燥救肺湯含藥血清+5%空白血清；清燥救肺湯高濃度組：NSCLC細胞+10%清燥救肺湯含藥血清。給藥后繼續培養24 h后進行后續實驗。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 平板克隆形成實驗觀察NSCLC細胞增殖能力 給藥24 h后，取各組細胞制備細胞懸液接種于6孔板中常規培養7 d，結晶紫染色，顯微鏡下觀察，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=形成的細胞克隆數/接種細胞數×100%。

1.6.2 Transwell細胞侵襲及遷移實驗Transwell小室包被基底膜（細胞侵襲實驗所需）。制備細胞懸液5×104個/mL，接種到Transwell小室中，繼續培養12~24 h。4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取5個視野，計算侵襲、遷移細胞數，取平均值。

1.6.3 PCR法檢測NSCLC細胞Th1細胞表型因子IFN-γ及Th2細胞表型因子IL-4及IGF-1R/STAT3通路相關蛋白IGF-1R、STAT3的基因水平PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個循環。以β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測NSCLC細胞IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達 將H1299細胞裂解離心取上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。IFN-γ（1∶1 000）、IL-4（1∶1 000）、IGF-1R（1∶1 500）、STAT3（1∶1 000）等一抗稀釋液4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）稀釋液37℃反應1 h。電化學發光法（ECL）顯色，曝光，凝膠成像系統（JY-Clear）分析目標條帶的光密度值，結果以目的蛋白灰度值與內參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.7統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據的統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，兩組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組NSCLC細胞克隆率比較空白血清組及清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞克隆率分別為（92.15±6.15）%、（83.11±4.16）%、（71.36±4.37）%、（52.31±5.02）%。4組組間比較，差異均有統計學意義（F=71.430，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞克隆率減?。≒＜0.05），呈濃度依賴性。各組細胞克隆情況見圖1。

圖1 各組NSCLC細胞平板克隆形成實驗結果Figure 1 Results of NSCLC cell plate clone formation assay

2.2各組NSCLC細胞侵襲能力比較空白血清組，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞侵襲數分別為（148±17）、（111±15）、（84±13）、（62±10）個。4組組間比較，差異有統計學意義（F=42.080，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞侵襲數量減少（P＜0.05），且呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 各組NSCLC細胞Transwell小室侵襲實驗結果（×400）Figure 2 Results of Transwell invasion assay of NSCLC cells（×400）

2.3各組NSCLC細胞遷移能力比較空白血清組，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞遷移數量分別為（108.01±11.34）、（85.73±5.14）、（67.33±6.44）、（44.52±6.79）個。4組組間比較，差異有統計學意義（F=72.050，P＜0.05）。與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞遷移數量減少（P＜0.05），且呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 各組NSCLC細胞Transwell小室遷移實驗結果（×400）Figure 3 Results of Transwell migration assay of NSCLC cells（×400）

2.4各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的mRNA表達比較與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞中IFN-γ mRNA表達水平升高，IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達水平降低（P＜0.05），呈濃度依賴性。見表2。

表2 各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達比較Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

表2 各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3 mRNA表達比較Table 2 Comparison of mRNA expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells of among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與清燥救肺湯低濃度組比較；③P＜0.05，與清燥救肺湯中濃度組比較

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2.5各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達比較與空白血清組比較，清燥救肺湯低、中、高濃度組NSCLC細胞中IFN-γ蛋白表達水平升高，IGF-1R、STAT3、IL-4蛋白表達水平降低（P＜0.05），呈濃度依賴性。見表3、圖4。

圖4 各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3的Western Blot電泳圖Figure 4 Western Blot electrophoretogram of IFN-γ，IL-4，IGF-1R，STAT3 in NSCLC cells

表3 各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達比較Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

表3 各組NSCLC細胞中IFN-γ、IL-4、IGF-1R、STAT3蛋白表達比較Table 3 Comparison of protein expressions of IFN-γ，IL-4，IGF-1R and STAT3 in NSCLC cells among various groups （±s，n=6）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與清燥救肺湯低濃度組比較；③P＜0.05，與清燥救肺湯中濃度組比較

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3 討論

腫瘤的發生是由于多種因素作用導致的，易發生侵襲和轉移，而肺癌在所有腫瘤類型中，發生侵襲和轉移的概率最高[6]。本研究結果顯示，經過清燥救肺湯干預后，NSCLC細胞克隆、侵襲及遷移能力降低，提示清燥救肺湯可抑制肺癌細胞的生長及轉移。

腫瘤的發生發展與機體免疫密切相關，機體的抗腫瘤免疫功能主要體現在細胞免疫。T細胞介導的細胞免疫在抗腫瘤免疫中至關重要。Th1細胞表型因子IFN-γ參與細胞毒性T細胞介導的細胞免疫，具有重要的抗腫瘤作用，可誘導NK細胞增強抗腫瘤活性；Th2細胞表型因子IL-4參與速發型超敏反應，通過抑制IFN-γ的產生，防止NK細胞活化，抑制細胞免疫的抗腫瘤效應，促進腫瘤細胞的生長[7-9]。本研究結果顯示，經過清燥救肺湯干預后，NSCLC細胞IFN-γ表達升高、IL-4表達降低，提示清燥救肺湯可上調NSCLC細胞IFN-γ表達并抑制IL-4表達，促進Th細胞向Th1型細胞分化，發揮抗腫瘤作用。

IGF-1R/STAT3通路參與多種腫瘤的產生及發展。IGF-1R是一種廣泛表達于多種類型細胞表面的酪氨酸激酶跨膜蛋白，主要介導IGF-1和IGF-2的生物學作用，參與機體物質代謝調節及胚胎發育等生物學過程，同時還能刺激腫瘤細胞增殖[10]。已有研究證實，IGF-1R信號通路影響腫瘤細胞的發生、發展、凋亡、各種途徑的轉移[11-12]。STAT3是IGF-1R/STAT3通路的成員，屬于STAT家族成員。有研究[13]表明，STAT3的激活可以促進肺癌發生和腫瘤血管形成，與肺癌的進展和預后密切相關。在相關細胞的作用下，炎癥因子通過激活STAT3的表達使其磷酸化后，可特異性地結合在相關因子的基因啟動子區，通過啟動相關基因的表達促進Th1細胞的分化[14-15]。本研究結果顯示，給予清燥救肺湯干預后，NSCLC細胞STAT3、IGF-1R表達隨著濃度的增加而降低，提示清燥救肺湯可抑制NSCLC細胞IGF-1R/STAT3通路的活化，發揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，清燥救肺湯可能通過促進IFN-γ表達，抑制IL-4表達，介導T細胞分化以調節免疫功能，同時抑制IGF-1R/STAT3通路活化，從而抑制NSCLC細胞的惡性行為。