柔肝通絡湯上調血管內皮生長因子及其受體表達對缺血性腦卒中大鼠腦皮質血管再生、神經元損傷的影響

楊秋怡， 王琪， 馬博

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

缺血性腦卒中（ischemic stroke）是常見的腦血管疾病，具有發病率高、致殘率高、預后差、易復發等特點，現階段不同年齡段人群中的發病率越來越高，但治療腦卒中疾病的藥物開發卻稍顯緩慢[1]，因此，尋找和探索有效的腦卒中防治藥物和方法具有重要的研究意義。缺血性腦卒中歸屬于中醫學“中風病”范疇。本課題組前期應用具有滋陰活血通絡功效的柔肝通絡湯臨床治療缺血性腦卒中取得良好療效，但其作用機制尚不明確。血管內皮生長因子（VEGF）家族是一類血管調節因子，在維護腦卒中神經血管單元穩態中發揮著關鍵作用[2-3]。因此，本研究構建缺血性腦卒中大鼠模型，采用柔肝通絡湯進行干預，以VEGF為切入點，觀察柔肝通絡湯對缺血性腦卒中模型大鼠腦皮質血管再生、神經元損傷的影響，探討柔肝通絡湯的干預靶點，以期為其臨床進一步應用治療腦卒中提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物選取SPF級健康雄性SD大鼠60只，4~6月齡，體質量140~250 g，廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0002，粵監證字2006A017。動物實驗于天津醫科大學動物實驗中心[動物使用許可證號：SYXK（津）2020-00010]完成，室溫15~20℃，濕度約為70%，每日12 h光照，喂養條件為自由攝取標準飼料，自由飲水。實驗過程嚴格按照《實驗動物管理條例》規定進行，實驗方案已經我院實驗動物倫理委員會審核批準。

1.2藥物、試劑與儀器所有中藥材由廣東藥科大學中醫藥研究院提供；阿司匹林片（四川新輝煌動物藥業有限公司，批號：獸藥字220771192）；兔抗VEGF單克隆抗體、兔抗血管內皮生長因子受體1（VEGFR1）單克隆抗體、兔抗血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）單克隆抗體，辣根過氧化酶標記抗兔IgG，血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）（北京中杉金橋公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡試劑盒（上海生物工程有限公司）；蛋白定量試劑盒（美國Bio-Rad公司）。XSZ-5B切片機（重慶光學儀器廠）；光學顯微鏡（桂林中輝科技發展有限公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）。

1.3柔肝通絡湯制備柔肝通絡湯組成：制首烏15 g、桑椹15 g、枸杞子30 g、丹參30 g、葛根30 g、當歸尾10 g、赤芍10 g、地龍10 g、山楂15 g。一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，取2次煎汁混合后文火煎制成膏狀（含生藥2 g/mL），冷藏備用。

1.4建模選取50只大鼠參照文獻方法[4]采用Zea-Longa線栓法構建缺血性腦卒中模型。2%戊巴比妥鈉麻醉注射后，使用3%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，術中對大鼠右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈進行分離處理，使用尼龍縫合線從大鼠的頸外動脈側端插入，由頸內動脈至距離頸外動脈和頸內動脈分叉口位置1.5 cm處停止該操作再穿入Willis環，阻斷右側大腦中動脈血供約1 h后將栓子拔出。術后控制大鼠體溫在37℃左右。將大鼠尾部提起后左側前肢表現為屈曲，則判斷造模成功。

1.5分組與給藥將造模成功的大鼠隨機分為模型組、柔肝通絡湯低劑量組、柔肝通絡湯中劑量組、柔肝通絡湯高劑量組、阿司匹林組，每組各10只。將剩余的10只大鼠設為正常組。柔肝通絡湯低、中、高劑量組分別給予5.0、10.0、20.0 g/kg（相當于50.0 kg成人等效劑量的0.5、1、2倍）柔肝通絡湯膏劑的生理鹽水溶液灌胃，阿司匹林組給予20.0 mg/kg阿司匹林生理鹽水混懸液灌胃，正常組與模型組給予生理鹽水15.0 mL/kg灌胃。每日1次，連續14 d。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 Bederson法評定大鼠神經功能缺損情況 將大鼠尾巴提起并高于桌面部分，正常大鼠前爪伸向桌面，腦卒中大鼠對側前肢屈曲。將大鼠放在利于爪子抓牢且有彈性的記錄紙上，將其尾部提起并用手輕推大鼠肩部，直至前肢滑動幾厘米為宜，并在不同方向重復，正常及輕度神經功能障礙大鼠會在不同方向以相同的力量抵抗推力。

評分標準[5]：神經功能健全為0分，前肢出現提尾懸空且不伴有其他不正常現象為1分，側推抵抗力下降并伴前肢屈曲和無轉圈行為2分，同2分行為并伴自發性旋轉為3分。得分越高表示神經功能損傷越嚴重。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腦組織病理變化 取腦去除嗅球及小腦部分后冷凍固定，石蠟包埋，冠狀切片（厚度為4 μm）。脫水后進行蘇木素、伊紅染色，烘干后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察后拍照。

1.6.3 TUNEL法檢測神經元凋亡 取腦皮質石蠟切片，脫蠟后按照說明書操作。顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒。計算神經元凋亡指數：陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.6.4 免疫組織化學法檢測腦皮質CD31表達取腦皮質石蠟切片（厚度4 μm），常規二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化；加3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗；加一抗CD31（1∶2 000稀釋）37℃孵育1 h，PBS沖洗；加二抗（1∶2 000稀釋）37℃孵育30 min，PBS沖洗；DAB顯色，鏡下觀察染色，終止反應，清水沖洗5 min；蘇木素淡染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，每張切片隨機選5個不重復的高倍鏡視野，應用Motic Images Advanced軟件進行分析，計算CD31陽性細胞（呈棕色顆粒）面積百分比。

1.6.5 Western Blot法檢測腦皮質VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達 取腦皮質裂解、離心取上清，BCA蛋白定量法測定蛋白含量。取總蛋白20 μg，高溫變性，加樣，15%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，濃縮膠所用電壓為80 V 30 min，分離膠電壓120 V 1 h，半干轉膜（VEGF轉膜40 min，VEGFR2轉膜15 min，VEGFR1轉膜15 min）。5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗VEGF（1∶1 000稀 釋）、VEGFR1（1∶1 500稀釋）、VEGFR2（1∶1 500稀釋）、β-actin（1∶2 000稀釋）4℃孵育過夜。次日，TBST液洗膜3次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，超敏化學發光（ECL）試劑顯色，曝光。最后應用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值表示。

1.7統計方法采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠神經功能損傷評分比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現神經功能明顯損傷。治療7、14 d后，與模型組比較，柔肝通絡湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠神經功能損傷評分降低，其中，除柔肝通絡湯低劑量組，其他各組差異均有統計學意義（P＜0.05）；而與阿司匹林組比較，柔肝通絡湯高劑量組大鼠神經功能損傷評分降低（P＜0.05）。給藥14 d后，各治療組大鼠神經功能損傷評分均低于給藥7 d后，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經功能損傷評分比較Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠神經功能損傷評分比較Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組同時間點比較；②P＜0.05，與模型組同時間點比較；③P＜0.05，與阿司匹林組同時間點比較

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2.2各組大鼠腦組織病理形態比較圖1結果顯示：正常組大鼠腦組織結構無異常，細胞排列整齊，無水腫及壞死現象；模型組及柔肝通絡湯低劑量組大鼠腦組織有壞死空洞、水腫形成，且組織結構紊亂、形態異常，炎癥細胞浸潤明顯；柔肝通絡湯中劑量組及阿司匹林組大鼠腦組織細胞腫脹現象較模型組有所減輕，炎癥細胞浸潤稍減輕，但仍伴有部分水腫現象；柔肝通絡湯高劑量組大鼠腦組織病灶范圍較模型組縮小，水腫明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結果（×400）Figure 1 HE staining results of brain tissue in various groups of rats（×400）

2.3各組大鼠神經元凋亡情況比較表2、圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠神經元凋亡指數升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠神經元凋亡指數降低，其中，除柔肝通絡湯低劑量組，其他各組差異均有統計學意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡湯高劑量組大鼠神經元凋亡指數降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠神經元TUNEL染色結果Figure 2 Results of TUNEL staining of neurons in various groups of rats（×200）

表2 各組大鼠神經元凋亡指數比較Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠神經元凋亡指數比較Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

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2.4各組大鼠腦皮質中CD31陽性表達比較表3、圖3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦皮質中CD31陽性表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠腦皮質中CD31陽性表達水平更高，其中，除柔肝通絡湯低劑量組，其他各組差異均有統計學意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡湯高劑量組大鼠腦皮質中CD31陽性表達水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦皮質血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）免疫組織化學結果Figure 3 Immunohistochemical results of CD31 in brain cortex of each group of rats（×200）

表3 各組大鼠腦皮質中血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）陽性表達水平比較Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats（±s）

表3 各組大鼠腦皮質中血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）陽性表達水平比較Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

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2.5各組大鼠腦皮質中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達比較表4、圖4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦皮質中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡湯中、高劑量組和阿司匹林組大鼠腦皮質中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡湯高劑量組大鼠腦皮質中VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平均升高（P＜0.05）。

圖4 各組腦皮質血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 proteins in cerebral cortex in various groups

表4 各組大鼠腦皮質中血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠腦皮質中血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

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3 討論

神經血管單元（neurovascular unit）概念的提出，為治療缺血性腦卒中提供了新靶點，即應針對包括神經元、微循環及神經膠質在內的整體進行治療，彌補以往單一針對神經元或血管治療的局限性[6]。而中醫藥基于“整體觀”特色理論可通過多層次、多靶點、多環節作用于相關調控基因的表達發揮腦保護的作用[7]。

腦卒中時因引起海馬區神經元損傷可造成相關神經功能的損害[8]。腦皮質結構功能的破壞程度與神經元損傷程度具有相關性[9]。本研究結果顯示，經柔肝通絡湯干預后，缺血性腦卒中大鼠神經功能損傷評分降低，表明柔肝通絡湯可改善缺血性腦卒中引起的神經功能受損，重塑神經功能。

當腦卒中發生時，腦內的神經元常表現為不可逆性壞死，且靠近核心區的半暗帶內的神經元因能量代謝障礙通常以凋亡形式走向死亡[10-12]。因此，遏止壞死區域的擴大、挽救半暗帶、抑制細胞凋亡是臨床腦保護及腦治療的主要靶點。腦卒中病灶邊緣區域是神經元凋亡發生最多的區域，存有大量處于休眠或半休眠狀態的可逆性神經元，若治療及時，神經元可向正常組織進行轉化，反之則會影響病情的發生發展[13]。本研究結果顯示，柔肝通絡湯組大鼠的腦神經元凋亡指數較模型組顯著降低，表明柔肝通絡湯可抑制神經元凋亡，發揮腦保護作用。

血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）是主要存在于血管內皮細胞中的一種糖蛋白，可作為血管生成標志物，在腦損傷疾病中可用于評價微血管密度，反映血管新生情況[14]。本研究結果顯示，柔肝通絡湯組大鼠腦皮質中CD31陽性表達水平顯著高于模型組，表明柔肝通絡湯可促進缺血性腦卒中大鼠腦皮質血管再生。

相關研究表明，腦卒中發生時血管內皮生長因子（VEGF）及其相關受體在誘導基因、蛋白的表達和調節血管通透性、腦皮質血管再生以及神經元損傷中發揮了關鍵作用。VEGF被認為是最有效的促進血管新生因子，可與其相關因子結合，在促進血管內皮存活、調節細胞周期、增加血管通透性及促進血管新生等方面發揮重要作用[15-16]。VEGF對神經元的營養和保護發揮越來越重要的作用，VEGF與VEGFR1、VEGFR2結合可促進缺血腦組織神經元的生長和存活[17-18]。本研究結果顯示，柔肝通絡湯組大鼠腦皮質中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平較模型組升高，表明柔肝通絡湯可上調缺血性腦卒中大鼠腦皮質VEGF及其受體的表達。

綜上所述，柔肝通絡湯可有效改善缺血性腦卒中大鼠腦組織病理學改變及神經功能損害，其機制可能與上調腦皮質VEGF及其受體的表達促進血管再生、抑制腦神經元凋亡有關。