幽門螺旋桿菌相關胃病脾胃濕熱證及脾氣虛證NLRP3/IL-1β的表達差異性研究

廖曉意， 陳昫， 唐舒婷， 樊冬梅， 蘭紹陽， 胡玲

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；3.廣州中醫藥大學科創中心，廣東廣州 510405）

眾所周知，胃癌（gastric cancer，GC）是一種發病率高、預后較差的惡性腫瘤。胃癌的發病機制尚未明確，目前普遍認為，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是最重要的危險因素。Hp感染導致胃黏膜慢性持續性炎癥，引發胃黏膜從良性到惡性的慢性淺表性胃炎（chronic superficial gastritis，CSG）→慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）→腸上皮化生（intestinal metaplasia，IM）→異型增生（dysplasia，Dys）→胃癌病變。Hp相關胃?。℉elicobacter pylori-related gastric diseases，HPGD）是對上述因Hp感染所引起的胃黏膜病變的簡稱。

本課題前期從“邪正交爭”角度對HPGD脾氣虛證和脾胃濕熱證的胃黏膜保護因子[熱休克蛋白70（HSP70）、黏蛋白1（MUC1）等]和攻擊因子[白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素8（IL-8）等]進行研究，發現其在不同證型中呈現出不同的表達趨勢[1]。其中，脾胃濕熱證的Hp感染程度和感染率明顯高于其他證型，同時伴隨胃黏膜炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-8等mRNA和蛋白水平的高表達[2]。采用高通量二代測序法對HPGD患者進行篩選，發現與慢性胃炎組相比，胃癌患者的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain-related protein 3，NLRP3）和IL-1β表達均顯著上調，提示NLRP3/IL-1β可能是HPGD胃黏膜病變過程中的關鍵炎癥因子[3]。因此，本研究擬通過觀察HPGD中脾胃濕熱證及脾氣虛證胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA的表達，進一步明確HPGD不同證型中炎癥因子的差異性表達，證實不同證候是HPGD的內在病理因素。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2019年11月至2020年11月于廣州中醫藥大學第一附屬醫院脾胃病科內窺鏡室及胃腸外科就診的95例HPGD患者為病例組，包括慢性淺表性胃炎43例，慢性萎縮性胃炎40例，胃癌12例；其中男53例，女42例。以上患者根據臨床表現分為脾胃濕熱證62例，年齡（53.79±12.84）歲；脾虛證33例，年齡（51.88±13.36）歲。同期于該院體檢中心隨機招募10例健康體檢者為正常對照組，其中1例因樣本質量不達標予以剔除，最終納入研究9例，包括男4例，女5例；年齡（51.00±11.25）歲。各組患者的一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得廣州中醫藥大學醫學倫理委員會批準（批號：NO.K【2020】128），胃黏膜標本及臨床信息的采集均獲得患者的知情同意。

1.2診斷標準慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎的診斷以《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》[4]作為標準，胃癌的診斷以2013年中華人民共和國衛計委頒布的《胃癌規范化診療指南（試行）》[5]作為標準；脾胃濕熱證和脾氣虛證的診斷標準以2002年《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[6]作為標準。

1.3納入標準

1.3.1 病例組納入標準 ①符合上述慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎或胃癌的診斷標準；②符合上述脾胃濕熱證或脾氣虛證的辨證標準；③自愿參加本研究，能配合胃黏膜標本及臨床信息采集的患者。

1.3.2 正常對照組納入標準 ①內鏡下提示慢性淺表性胃炎，無活動性炎癥，Hp檢測陰性；②無呼吸、循環、泌尿、神經系統疾病及其他消化系統疾??；③無胃病的相關臨床癥狀，舌淡紅，苔薄白，脈象平和；④自愿參加本研究，能配合胃黏膜標本及臨床信息采集的受試者。

1.4排除標準①合并有嚴重的心、腦、肺、肝、神經系統疾病患者；②近1個月使用過質子泵抑制劑或行Hp根除療法的患者；③近期有消化道出血病史的患者；④孕婦、哺乳期的婦女。

1.5胃黏膜標本的采集研究對象均行電子胃鏡檢查，于胃竇距幽門口2～3 cm處的大、小彎或前、后壁鉗取4塊大小約0.2～0.3 cm的胃黏膜組織，其中1塊行病理組織學檢測，1塊行快速尿素酶試驗；2塊放入裝有RNA保存液的凍存管中后，立即投入液氮瓶并送至-80℃低溫冰箱中保存，以備采用實時熒光定量多聚酶鏈式反應（quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測mRNA表達水平。胃癌標本則剪取手術切除的癌組織、距離腫物3 cm以上的遠癌組織各4塊，處理同前。

1.6Hp感染情況的檢測采用快速尿素酶試驗及胃黏膜病理切片美藍染色法檢測患者的Hp感染情況。兩者均為陽性，其標本可診斷為Hp感染者；兩者均為陰性，其標本則診斷為非Hp感染者；一陰一陽者不納入本研究。

1.6.1 快速尿素酶試驗 內鏡下鉗取胃黏膜組織，立即置于幽門螺桿菌試紙上，等待3 min，觀察試紙顏色變化，不變色者為Hp陰性，變紅者為Hp陽性。

1.6.2 胃黏膜病理切片美藍染色法檢測 美藍染色采用按照硼酸0.5 g+亞甲藍0.5 g+蒸餾水100 mL的比例配成的硼酸亞甲藍液。將胃黏膜組織塊固定于體積分數為4%的多聚甲醛內，常規酒精脫水，石蠟包埋，切片。切片脫蠟、脫水后，滴加硼酸亞甲藍液5～10 min，水洗，封片，電子顯微鏡下觀察、拍照。對醫師采用盲法，并設定同一條件，由兩名資深病理科醫師分別完成所有胃黏膜標本Hp感染程度的評估。詳見圖1。

圖1 不同幽門螺桿菌（Hp）感染程度的胃黏膜表現（美藍染色，×400）Figure 1 Gastric mucosal manifestations of the studying subjects with different degrees of Hp infection（methylene blue stain，×400）

1.7胃黏膜中NLRP3和IL-1β mRNA表達水平的檢測標本外送廣州華銀健康科技有限公司行qRT-PCR法檢測。按TRIzol試劑操作說明書提取細胞RNA。使用反轉錄引物進行逆轉錄，在PCR儀中將RT反應程序設為：25℃5 min，55℃60 min，70℃15 min，12℃結束，再使用反轉錄產物（cDNA）做熒光PCR。以hGAPDH作為內參基因，NLRP3、IL-1β轉錄水平以2-ΔΔCt表示，實驗重復3次，取平均值。引物序列見表1，引物擴增圖見圖2。

圖2 NLRP3（A）、IL-1β（B）反轉錄引物擴增曲線圖Figure 2 The amplification curve of reverse-transcription primers of NLRP3（A）and IL-1β（B）

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8統計方法采用SPSS 26.0統計軟件進行數據的統計分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，滿足正態性且方差齊者，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析；不滿足正態性或方差齊性者，組間比較選用Kruskal-WallisH檢驗。計數資料用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；變量間相關性分析采用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HPGD不同證型患者的Hp感染率比較表2結果顯示：HPGD脾胃濕熱證和脾氣虛證患者的Hp感染率分別為82.26%（51/62）、75.76%（25/33），脾胃濕熱證患者的Hp感染率有高于脾氣虛證患者的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 幽門螺桿菌（Hp）相關胃?。℉PGD）不同證型患者Hp感染率比較Table 2 Comparison of Hp infection rate in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types [例（%）]

2.2HPGD不同證型患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平比較表3結果顯示：與正常對照組相比，HPGD脾胃濕熱證和脾氣虛證患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。脾胃濕熱證患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平均有高于脾氣虛證患者的趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同證型患者NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 3 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types and in normal control group（±s，2-ΔΔCt）

表3 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同證型患者NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 3 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types and in normal control group（±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與正常對照組比較

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2.3HPGD不同病種患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表達水平比較表4結果顯示：與正常對照組相比，HPGD各病例組患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。胃癌患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平有高于慢性萎縮性胃炎、慢性淺表性胃炎的趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表4 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同病種患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with different types of HPGD （±s，2-ΔΔCt）

表4 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同病種患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with different types of HPGD （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與正常對照組比較

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2.4胃癌患者胃黏膜不同部位的NLRP3和IL-1βmRNA表達水平比較表5結果顯示：對胃癌患者的癌組織和距離腫物3 cm以上的遠癌組織胃黏膜標本的NLRP3和IL-1β mRNA表達水平進行配對樣本t檢驗（因其中2例遠癌組織樣本因采集檢測不達標予以剔除，納入剩余10例行配對檢驗），與遠癌組織相比，癌組織胃黏膜標本的NLRP3 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），IL-1β mRNA表達水平有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

表5 胃癌患者不同部位組織NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in tissues from different sites of gastric cancer patients （±s，2-ΔΔCt）

表5 胃癌患者不同部位組織NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in tissues from different sites of gastric cancer patients （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與遠癌組織組比較

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2.5HPGD不同Hp感染情況患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平比較表6結果顯示：與Hp陰性患者相比，Hp陽性患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），說明Hp感染可導致NLRP3、IL-1β表達水平升高。

表6 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同Hp感染情況患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 6 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in HPGD patients with different Hp infection profiles （±s，2-ΔΔCt）

表6 幽門螺桿菌相關胃?。℉PGD）不同Hp感染情況患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表達水平比較Table 6 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in HPGD patients with different Hp infection profiles （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，與Hp陰性組比較

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3 討論

幽門螺桿菌（Hp）是一種革蘭氏陰性菌，作為常見的致病菌，全球約有50%的人受到感染[7]。1994年，Hp被國際胃癌研究機構列為人類Ⅰ級致癌物。目前廣泛認為根除Hp可有效預防胃癌的發生，延緩慢性淺表性胃炎（CSG）→慢性萎縮性胃炎（CAG）→腸上皮化生（IM）→異型增生（Dys）→胃癌（GC）的演變過程。在中醫學中，CSG、CAG、GC等胃病多根據其癥狀表現可歸屬于“胃痛”“胃痞”“嘔吐”“呃逆”“噎膈”等范疇，其病變部位在胃，與脾、肝關系密切。其中脾與胃同屬中焦，互為表里，兩者緊密相連，因此胃病也多可牽連于脾。對不同證型的胃黏膜病理觀察結果顯示，脾胃濕熱證患者的胃黏膜病理多表現為隆起糜爛[8]，脾氣虛證患者多表現為黏膜白相增多[9]，且前者炎癥程度高于后者。說明不同證型可能是導致胃黏膜病理變化的內在因素，且與炎癥因子的異常高表達密切相關。

本研究結果顯示：脾胃濕熱證HPGD患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平顯著高于正常對照組，且與脾氣虛證患者比有偏高的表達趨勢，證實了脾胃濕熱證與NLRP3、IL-1β的內在聯系。同時發現脾胃濕熱證Hp感染率有高于脾氣虛證的趨勢，這與本課題組前期的研究結果及國內相關研究結果一致[9-10]。中醫對脾胃濕熱的描述最早可見于《素問·至真要大論》，提出：“諸濕腫滿，皆屬于脾?！敝嗅t認為，濕熱證具有病性黏滯、纏綿難愈的特點。目前普遍認為，Hp在病因上可歸于中醫外感邪氣范疇，與濕熱邪氣致病的機制類同，且其難以根治、易反復感染的致病特征與濕熱黏滯的發病特點極為相似。同時，“濕熱”也是Hp生長、繁殖的內在環境。“濕熱”的中心病位在脾胃，脾為濕臟、胃為燥臟，脾胃同居中焦，主運化水液，故“濕熱”易在脾胃滋生盤踞。由此可見，脾胃濕熱證與Hp感染互相影響，互為因果。

薛雪的《濕熱病篇》將濕熱的發病機理概括為“太陰內傷，濕飲停聚，客邪再至，外內相引，故病濕熱”，即內傷為本，外邪是因，這與Hp感染和脾胃濕熱證的致病過程不謀而合。Hp感染是HPGD脾胃濕熱證發病的外因，而NLRP3、IL-1β等炎癥因子在細胞內的過度表達則是從內部協同Hp致病，導致胃黏膜持續的炎癥狀態，從而引起病理結構改變。NLRP3炎癥體的激活可能是脾胃濕熱證的生物學實質之一，是參與脾胃濕熱證HPGD發病的重要因素。

NLRP3炎癥體是一種包括NLRP3蛋白和適配器ASC的半胱氨酸天冬氨酸酶1（caspase-1）激活分子平臺，其中NLRP3蛋白作為一種模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs），可定向識別宿主細胞質中的微生物分子[11]。Hp通過其主要毒力因子細胞毒素相關基因A（cytotoxin-associated gene A，Cag A）蛋白刺激NLRP3蛋白，激活NLRP3炎癥體，從而活化caspase-1。活性caspase-1可促進IL-1β的成熟、釋放，成熟的IL-1β參與多種免疫反應，其接收內皮細胞的傳導信號，將免疫細胞募集到感染或受損部位[12]。IL-1β炎癥反應可以抑制胃酸分泌并引起胃腺體萎縮，從而促進定植菌的近端遷移，引起胃內微環境改變，造成體部或多灶性胃炎，后者往往會向腸上皮化生發展，最終演變為腸型胃癌。此外，它還可以直接誘導胃癌細胞的增殖[13-15]。

本研究對HPGD不同病種的NLRP3、IL-1β mRNA表達水平進行比較，結果顯示：病例組較正常對照組顯著升高，其中GC較CSG、CAG有更高的表達趨勢。同時，對GC患者胃黏膜癌組織和遠癌組織的NLRP3、IL-1β mRNA表達進行比較，發現癌組織炎癥因子表達水平顯著高于遠癌組織。以上結果均說明NLRP3、IL-1β與GC的發生密切相關，NLRP3、IL-1β或許可作為GC早期篩查和治療的靶點。結合課題組前期對GC和正常受試者胃黏膜的高通量二代基因測序，結果顯示IL-1β的表達在GC中顯著上調，且差異基因通過NOD樣受體信號通路進行富集[3]，故認為Hp可激活NLRP3炎癥體，從而提高IL-1β在HPGD患者胃黏膜中的表達，引起炎癥級聯反應，參與CSG→CAG→IM→Dys→GC的病理過程。

綜上所述，Hp感染后胃黏膜的IL-1β、NLRP3的高表達，導致胃黏膜的慢性持續性炎癥，可能是引起胃黏膜惡性轉變的重要因素之一。而脾胃濕熱證可能是Hp感染后的內在病理因素之一，其與外邪Hp感染協同，共同參與Hp相關胃病由良性至惡性發展的過程。由于本研究納入樣本量仍較少，脾胃濕熱證和脾氣虛證的NLRP3、IL-1β mRNA表達均高于正常受試者，但兩組之間比較差異均無統計學意義，后續將繼續擴大樣本，并擴展更多中醫不同證候，以進一步證實中醫證候參與Hp感染后的胃黏膜不同結局的過程，為中醫藥根除Hp防治胃癌提供更多基礎理論依據。