初診彌漫大B細胞淋巴瘤患者骨髓來源抑制性細胞的亞群分布及功能異常分析

劉靜茹，陳書鋮，2，許凱明，陳加弟，黃慧芳

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常見的成人B細胞淋巴瘤，生長迅速，侵襲性高，近半數患者治療后發生耐藥，轉變為復發或難治型，成為目前DLBCL臨床治療中亟待解決的難點[1]。針對DLBCL的免疫監測和免疫治療為該病的診療提供了新手段[2]。骨髓來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)是一類來源于骨髓且具有免疫抑制功能的細胞[3]。人體內MDSC可分為單核細胞性骨髓來源抑制性細胞(monocyte myeloid-derived suppressor cell，M-MDSC)和粒細胞性骨髓來源抑制性細胞(granulocyte myeloid-derived suppressor cell，G-MDSC)兩大亞群，不同亞群的免疫抑制機制有所不同[4]。MDSC異常擴增和聚集可以削弱機體的免疫應答能力，導致免疫治療效力下降[5]。作為潛在的臨床標志物和治療靶點，目前文獻報道[6-7]多關注于M-MDSC 與實體腫瘤疾病的臨床相關性，對 DLBCL患者的骨髓和外周血中M-MDSC與G-MDSC表達差別及其功能在DLBCL中扮演的角色尚無一致的結論。本研究采用多色流式細胞術分析初診DLBCL患者和健康供者外周血、骨髓標本中的M-MDSC 和G-MDSC兩大亞群的分布差別，同時檢測其功能，探討DLBCL患者免疫微環境異常的機制。

1 對象與方法

1.1 對象 收集50例初診DLBCL患者和30例健康供者的外周血標本，10例初診DLBCL患者和10例健康供者的骨髓標本。其中初診DLBCL患者來自2021年8月—2022年5月就診于福建醫科大學附屬協和醫院(本院)且均符合DLBCL臨床診斷標準[8](包括疾病分期、血清乳酸脫氫酶水平、有無B癥狀以及淋巴瘤IPI評分等內容)；健康供者外周血標本來源于本院健康體檢中心，健康供者骨髓標本來源于本院移植中心。上述所有受檢者均無傳染性疾病、自身免疫性疾病和其他腫瘤疾病。本研究已通過本院倫理委員會批準(2021WSJK018)，患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器 紅細胞裂解液(北京天根生化科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)(北京索萊寶科技有限公司)，活性氧(reactive oxygen species, ROS)試劑盒(上海碧云天科技有限公司)，胎牛血清和普通1640培養基(美國Gemini公司)，CD45-eFluor 506和CD15-eFluor 450單克隆抗體(美國Thermo-Fisher科技公司)，人Fc受體阻斷劑、CD33-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE及CD14-APC-Cy7單克隆抗體(美國Biolegend公司)，HLA-DR-APC和BD FACS Celesta分析型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 外周血和骨髓MDSC亞群流式檢測 收集研究對象的EDTA抗凝靜脈血和肝素抗凝骨髓標本，從中吸取120 μL至流式管中，每管加入1 μL人Fc受體阻斷劑以降低非特異性染色，放置室溫孵育10 min 后直接加入HLA-DR-APC 10 μL，CD45-eFluor 506、CD15-eFluor 450、CD33-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE及CD14-APC-Cy7抗體各2.5 μL，放置4 ℃ 孵育30 min，用PBS(含2%胎牛血清)洗滌1次，1 400 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入3 mL 紅細胞裂解液，放置4 ℃裂解25 min，1 400 r/min 離心5 min，棄上清液，用PBS(含2%胎牛血清)洗滌1次，加入500 μL PBS(含2%胎牛血清)重懸細胞。本研究以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+CD14+CD15-作為M-MDSC的免疫表型；以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+CD15+CD14-作為G-MDSC 的免疫表型，通過BD FACS Celesta流式細胞儀分別檢測各標本中M-MDSC和G-MDSC兩大亞群，采用Flowjo V10.8.1軟件分析相關數據，以M-MDSC和G-MDSC占CD45+細胞中比例作為最終數據統計結果。

1.4 DCFH-DA探針法檢測外周血M-MDSC和G-MDSC的ROS表達 采用普通1640培養基按照1∶1 000稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L；收集研究對象的外周血標本，使其懸浮于稀釋過的DCFH-DA探針中，調整細胞濃度為1×106mL-1，放置37 ℃細胞培養箱孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻，使細胞與探針充分接觸。采用普通1640培養基洗滌細胞3次，充分去除游離的DCFH-DA探針。收集細胞進行MDSC流式抗體染色(方法同外周血和骨髓MDSC亞群流式檢測)，通過BD FACS Celesta流式細胞儀檢測各標本中M-MDSC和G-MDSC的ROS表達水平，采用Flowjo V10.8.1軟件分析相關數據，以平均熒光強度(mean fluores cence intensity，MFI)作為最終數據統計結果。

2 結 果

2.1 MDSC及其亞群的流式分析設門策略 本研究以CD45+HLA-DR-CD33+CD11b+細胞群體作為MDSC分析[6]，根據其是否表達CD14和CD15區分M-MDSC和G-MDSC。其中CD14+CD15-MDSC為M-MDSC，CD15+CD14-MDSC為G-MDSC，詳細流式分析設門策略見圖1。

MDSC：骨髓來源抑制性細胞；G-MDSC：粒細胞性骨髓來源抑制性細胞；M-MDSC：單核細胞性骨髓來源抑制性細胞。

2.2 MDSC亞群在初診DLBCL患者外周血分布情況 初診DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC 及G-MDSC的亞群比例分布情況見圖2A。多色流式結果表明：與健康供者比較，初診DLBCL患者外周血中M-MDSC較高，差別有統計學意義(P=0.001，圖2B)；初診DLBCL患者外周血中G-MDSC比例與健康供者比較，差別無統計學意義(P=0.770，圖2C)。

DLBCL:彌漫大B細胞淋巴瘤；MDSC：骨髓來源抑制性細胞；G-MDSC：粒細胞性骨髓來源抑制性細胞；M-MDSC：單核細胞性骨髓來源抑制性細胞。A：初診DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC和G-MDSC的亞群比例分布情況；B：初診DLBCL患者和健康供者外周血M-MDSC比例(與健康供者M-MDSC比較，△：P<0.05)；C：初診DLBCL患者和健康供者外周血G-MDSC比例。

2.3 MDSC亞群在初診DLBCL患者骨髓中分布情況 初診DLBCL患者和健康供者骨髓中M-MDSC 及G-MDSC的亞群比例分布情況見圖3A。初診DLBCL患者骨髓M-MDSC比例高于健康供者，差別有統計學意義(P=0.001，圖3B)；初診DLBCL組患者骨髓G-MDSC比例與健康供者比較，差別無統計學意義(P=0.213，圖3C)。

DLBCL:彌漫大B細胞淋巴瘤；MDSC：骨髓來源抑制性細胞；G-MDSC：粒細胞性骨髓來源抑制性細胞；M-MDSC：單核細胞性骨髓來源抑制性細胞。A：初診DLBCL患者和健康供者骨髓M-MDSC和G-MDSC的亞群分布情況；B：初診DLBCL患者和健康供者骨髓M-MDSC比例(與健康供者M-MDSC比較，△：P<0.05)；C：初診DLBCL患者和健康供者骨髓G-MDSC比例。

2.4 初診DLBCL患者外周血M-MDSC和G-MDSC 的ROS表達水平 DCFH-DA探針法檢測結果可見：初診DLBCL患者外周血M-MDSC的ROS表達水平與健康供者比較，差別無統計學意義(P=0.098，圖4A～B)；初診DLBCL患者外周血G-MDSC的ROS表達水平高于健康供者，差別有統計學意義(P=0.001，圖4C～D)。

3 討 論

MDSC是一類高度異質性的骨髓來源性細胞，一直是炎癥免疫研究的熱點[5]。健康人外周血中MDSC數量極少，在炎癥或感染等病理狀態尤其是腫瘤發生時，骨髓腔受異常信號持續刺激，髓細胞分化能力大大降低，MDSC大量擴增并通過外周血循環聚集于腫瘤和外周淋巴器官，通過抑制T細胞激活、促進巨噬細胞促腫瘤生長表型極化等作用影響機體免疫功能[9-10]。根據表面標記可將MDSC分為M-MDSC和G-MDSC，不同亞群MDSC免疫抑制機制有所不同[4]。研究表明，MDSC與非小細胞肺癌、乳腺癌等腫瘤的發生、發展密切相關[11-15]。LIAO 等[16]在小鼠模型中通過抑制CXCR2、上調CXCL3表達等節點調控可募集MDSC，進而削弱腫瘤殺傷性T細胞免疫功能。

本研究在MDSC流式細胞染色方法中簡化了外周血和骨髓中的MDSC及其亞群的檢測步驟，無需進行外周血單個核細胞梯度分離這一繁瑣操作，可作為MDSC臨床檢驗方法學中的一種參考方法。經檢測發現，M-MDSC在初診DLBCL患者外周血和骨髓中的比例呈一致性增加，但G-MDSC與健康供者相比差別無統計學意義，提示DLBCL患者機體免疫功能受損可能與M-MDSC異常擴增及聚集關聯。本研究后續將動態監測DLBCL患者從初次化療至完全緩解整個階段的外周血和骨髓中M-MDSC 水平，充分探討M-MDSC分布是否可作為DLBCL療效監測的一項指標。

ROS具有調控細胞信號傳導和體內平衡等多種主要代謝途徑的重要作用[4]。本研究中，與健康供者比較，M-MDSC的ROS表達水平差別并無統計學意義。有意思的是，雖然G-MDSC的數量在初診DLBCL患者與健康供者中差別并無統計學意義，但ROS作為G-MDSC的主要功能，在初診DLBCL 患者外周血中呈現較高的表達水平，提示除了M-MDSC在DLBCL患者體內異常擴增之外，G-MDSC 出現功能異常也可能是影響DLBCL患者機體免疫功能異常及疾病發生、發展的另一因素，G-MDSC 主要通過調控ROS表達使免疫細胞處于無應答或耐受狀態[9]。同時，DLBCL患者體內G-MDSC 功能可能受到多種因素影響，如M-MDSC與G-MDSC是否會互相作用調控，而其他類型的免疫細胞如巨噬細胞、調節性T細胞等是否會影響G-MDSC 功能等。另一方面，異常表達的ROS對G-MDSC自身數量并無影響，這種自我保護狀態也是筆者感興趣的一個研究方向。若減少G-MDSC或抑制其ROS表達，可有效減輕其對DLBCL患者的機體損傷。筆者擬在后續研究中增加骨髓標本數量，充分探討G-MDSC功能異常對DLBCL患者骨髓微環境的影響。

本研究尚存一些不足之處，如檢測細胞比例和功能測定的方法過于單一、骨髓標本數量較少等；另外，應結合臨床資料從機制上對MDSC兩大亞群進行進一步分析。

綜上所述，初診DLBCL患者外周血和骨髓中M-MDSC異常聚集，表達水平顯著升高；G-MDSC雖然在數量上無顯著變化，但其主要功能ROS表達顯著高于健康供者。檢測MDSC亞群分布情況有利于進一步了解DLBCL患者免疫微環境異常的可能原因，隨著研究深入，有望成為監測DLBCL療效的一項指標。