阿爾茨海默癥發病機制及基于吡喃/啶酮骨架的多靶點藥物的研究進展

劉雪艷(綜述)，查代君(審校)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關的慢性疾病，也是導致癡呆的最常見的原因。作為一種神經退行性疾病，AD患者伴隨認知和行為功能受損，并最終導致死亡。根據WHO的數據，目前全世界約有5 000萬例AD患者[1]。預計到2050年，病例數將超過1.5億，給社會造成重大負擔[2]。中國AD患者的數量不僅位居世界第一，其增速也是全球最快的。據估計，我國60歲以上人群的AD發病率將從2010年的12%增至2050年的33%，治療費用也將超過1萬億元[3]。隨著我國老齡化進程的加劇，AD給患者的家庭帶來沉重的經濟、情感和精神壓力，防治AD已經刻不容緩。

雖然AD的發病機制已研究了100多年，但確切的病因尚不清楚[4]，普遍認為AD的發病與多種因素有關，如年齡、家族遺傳和代謝性因素等。AD的主要病理特征如下：患者大腦皮質和海馬區沉積的β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein, Aβ)形成大量老年斑(senile plaques, SP)，神經元胞體內因Tau蛋白異常聚集出現神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)，并伴有神經元的大量丟失[5-7]。此外，部分研究認為，神經炎癥、氧化應激、生物金屬的穩態失調和神經遞質缺陷等與AD的發生和發展也密切相關[8]。多種病理因素的交互作用共同導致了記憶缺陷甚至是認知功能障礙，進而促進AD的進展[9]。

目前已發現許多影響AD發生發展的主要靶點，例如乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)、β-位點淀粉樣前體蛋白切割酶-1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE-1)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)、大腦中的生物金屬離子、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)受體、組胺受體的第三亞型(H3受體)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)[10-11]。這些靶點與各自的信號通路以及彼此之間發揮作用共同影響AD的進展，形成AD復雜而不明確的疾病網絡(圖1)。

圖1 阿爾茨海默病的主要發病學說及其靶點

1 發病機制

1.1 膽堿能假說 1976年由戴維斯和馬洛尼首次提出膽堿能假說，這是目前AD研究中最為經典的假說。膽堿能假說將認知功能障礙歸因于乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的消耗[12]。ACh作為一種參與學習和記憶的神經遞質，在體內可被AChE和丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase, BuChE)水解而消耗。研究認為，低水平的ACh與AD患者的認知障礙密切相關，通過抑制AChE和BuChE來提高ACh水平是改善認知功能的有效策略[13]。健康成年人大腦中AChE的比例約為80%，其余為BuChE[14]。AChE有兩個主要的結合位點，包括峽谷底部的催化陰離子位點(CAS)和峽谷頂部的外圍陰離子位點(PAS)。大量證據表明，位于PAS的Trp279(eeAChE)或Trp286(huAChE)可加速Aβ斑塊的形成并加重其神經毒性。BuChE主要定位于神經膠質細胞中，在人腦ACh的調節中也發揮著重要的作用。研究發現，在健康大腦中，大部分的ACh由AChE水解。但在受AD影響的大腦中，AChE水平顯著降低，而BuChE活性增加，導致ACh主要由BuChE水解。不難看出，AChE和BuChE在AD的不同階段所起的作用不同。在AD進展期，BuChE起主導作用，已成為治療中重度AD的作用靶點。基于此，開發AChE和BuChE雙重抑制劑有利于解決AD不同病理階段的問題。此外，選擇性BuChE抑制劑還可有效避免AChE抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor, AChEI)的外周副作用，因此格外受關注[15]。

AChE是目前藥物化學研究中防治AD的最主要的靶點和基本評價標準之一，抑制AChE可防止突觸ACh的降解[16]。目前FDA批準的臨床藥物主要是AChEI，如多奈哌齊、加蘭他敏和利凡斯的明。他克林作為第一個用于治療AD的AChEI，于1993年批準上市，由于肝毒性已被停用，但其結構對新藥的設計仍然具有指導意義。衛材公司和輝瑞公司研發的多奈哌齊是全球最暢銷的AD藥物，于1997年批準用于治療輕中度AD，于2014年批準用于路易體癡呆的輔助治療。根據目前的臨床證據，多奈哌齊是一種安全且耐受性良好的藥物，即使對嚴重的AD患者，也具有較好地改善認知功能的作用。目前，他克林和多奈哌齊仍被各研究小組深入研究，并常被用于體外酶活性試驗和體內AD相關動物模型的藥理實驗陽性對照，以檢測AChE的抑制效力和安全性。膽堿能假說和已批準的藥物使AChEI在AD領域備受矚目，針對AChE的單靶點策略和涉及AChE的多靶點策略成為AD潛在藥物設計的共同思路。

1.2 Aβ異常沉積 Aβ假說是目前AD進展中最為流行的假說，由哈代和希金斯于1992年首次提出。Aβ級聯反應學說認為：AD是由膜內淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)的異常水解和錯誤折疊所致的一種淀粉樣變性疾病。APP是一種在大腦中高度表達的跨膜蛋白，其C端和N端分別通過神經元細胞的磷脂雙分子膜層。一組分泌酶介導APP兩種不同的代謝途徑：α-分泌酶介導的非淀粉樣蛋白途徑導致片段容易降解，而β-分泌酶和γ-分泌酶介導的淀粉樣蛋白途徑導致Aβ肽的形成[17]。APP的降解主要通過α-分泌酶和γ-分泌酶催化的兩步蛋白水解反應，不伴隨物理損傷。而另有一小部分APP被β-分泌酶裂解，產生可溶性sAPPβ和CTFβ片段，該片段進一步裂解，產生APP胞內結構域AICD和Aβ(圖2)[18-19]。Aβ由37～49個氨基酸殘基組成，其中以Aβ40和Aβ42肽為代表。Aβ聚集增加、Aβ42/Aβ40比值增加、Aβ積累和Aβ清除減少等各種因素加速了大腦中SP的形成，進而導致AD的進展[20]。

圖2 Aβ的形成示意圖

經典的Aβ假說表明，Aβ(特別是Aβ1-42)通過聚集成低聚物、原纖維，并最終形成斑塊，進而引發線粒體功能障礙、慢性炎癥和神經元損傷等一系列病理反應[21]。研究發現，Aβ可通過不同的機制誘導毒性作用。例如，Aβ在大腦中的積累會導致突觸的喪失、神經元活動和突觸傳遞的改變。此外，Aβ也參與了金屬介導的氧化應激反應，還可以激活一系列病理事件，包括星形膠質細胞和小膠質細胞的激活，血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的崩潰和微循環的變化等。

鑒于Aβ假說以及抑制Aβ沉積可干預AD進展的共識，BACE-1抑制劑治療AD成為一個有吸引力的治療策略[22]。然而，BACE-1抑制劑的研發現狀卻異常殘酷。由于缺乏療效和安全性不佳，百健和衛材公司Ⅲ期臨床試驗藥物Elenbecestat于2019年終止研究；禮來公司Ⅱ期臨床試驗藥物LY3202626由于缺乏具有統計學意義的療效也于2021年宣布終止。

1.3 過度磷酸化的Tau蛋白 Tau蛋白假說是基于大腦細胞內的NFT，這是AD的另一個組織病理學標志[23]。Tau蛋白假說認為，Tau蛋白過度磷酸化在AD的發病過程中起關鍵作用。Tau蛋白是一種可溶性微管相關蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)，其主要生理功能是與微管蛋白形成微管，維持微管穩定，促進微管聚集。當Tau蛋白被高度保守的蘇氨酸-絲氨酸激酶GSK-3β過度磷酸化時，Ser396、Ser199和Ser413等位點的磷酸基從原始的2～3個增至5～9個，導致Tau蛋白無法與微管結合，造成微管的不穩定。同時，解離的Tau蛋白在神經元中積累和聚集，導致NFT的形成和神經元死亡[24]。自動高通量熒光成像系統研究表明，GSK-3β活性的異常增加還可導致β-分泌酶定位/缺陷和Aβ的分泌[25]。研究發現，GSK-3β在小膠質細胞和星形膠質細胞中均有表達，可促進細胞因子的產生，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)等，并可通過調節神經炎癥過程促進神經疾病的發生和進展。此外，GSK-3β還可以一種獨特的方式調節γ-分泌酶，誘導Aβ的形成，從而對神經元產生毒性。GSK-3β是上游Tau通路的主要特異性靶點，也是最受歡迎的小分子化合物研究靶點之一。抑制過度磷酸化的Tau蛋白聚集或阻斷Tau蛋白的過度磷酸化是兩種可能的策略。基于Tau蛋白聚集抑制劑對AD潛在的治療作用使其越來越受到關注，目前已有多家制藥公司正在對Tau蛋白抗體開展臨床試驗，如AC Immune與基因泰克公司聯合開發的抗Tau蛋白單克隆抗體Semorinemab，強生公司針對靶向中區表位的致病性Tau單克隆抗體JNJ-63733657，以及Axon Neuroscience SE公司針對AD病理性Tau蛋白的活性肽疫苗AADvac1[26]。

1.4 神經炎癥 神經炎癥主要表現為中樞神經系統(central nervous system，CNS)中的膠質細胞的穩態失衡，是AD發病機制的關鍵因素。小膠質細胞作為CNS中的固有免疫細胞，在CNS的先天免疫反應中起著關鍵作用。在AD最初的病理過程中，小膠質細胞和星形膠質細胞發揮有益作用，如參與了淀粉樣蛋白的清除。然而，隨著疾病的進展，活化的小膠質細胞可表達促炎細胞因子(如IL-1β、IL-6 和TNF-α)，伴隨Aβ的清除能力下降，從而加劇神經退行性變。此外，在慢性神經炎癥期間，BBB經常受到損害，進一步加重了神經炎癥反應。同時，炎癥環境可進一步促進SP和NFT的形成，導致AD的進一步惡化。因此，保持小膠質細胞的穩態可能是治療神經炎癥介導的神經退行性疾病的一種有效策略。新近研究發現，IL-3是星形膠質細胞-小膠質細胞串擾的關鍵中介物，可直接誘導神經元凋亡或放大局部炎癥反應，可能是AD治療的一個關鍵靶點[27]。集落刺激因子1受體(colony stimulating factor-1 receptor, CSF-1R)在CNS中能夠直接參與小膠質細胞的分化及生長，并可減少蛋白沉積，因此靶向小膠質細胞的CSF-1R抑制劑在AD的治療中極具潛能[28]。此外，主要表達在小膠質細胞上的髓系細胞觸發受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2, TREM2)不僅可影響Aβ和Tau蛋白的沉積，還可以參與炎癥反應和代謝，也成為AD領域藥物研發的潛力靶點[29]。然而，目前對于TREM2靶點的研究尚處于起步階段，其中安進公司的VGL-101單克隆抗體和德納利公司的DNL-919抗體處于臨床前研究階段，Alector公司研發的AL-002單克隆抗體正在進行臨床Ⅱ期試驗[30]。

1.5 氧化應激(oxidative stress, OS) 由于大腦對氧氣的高需求和抗氧化防御系統的缺乏，使大腦非常容易受到OS的傷害。OS水平升高被認為是導致AD發病的早期事件之一，最終導致神經退行性變。大量證據表明，活性氧(reactive oxygen species, ROS)與線粒體氧化還原系統的失衡密切相關。從線粒體內膜泄漏的電子與氧原子之間發生反應產生高反應性的超氧陰離子，這些超氧自由基可以進一步進行自由基鏈反應，生成其他ROS，如過氧化氫和羥基離子[31-32]。研究發現，ROS的過度生成導致OS，OS在AD的發病機制和病理生理學中起關鍵作用。AD早期的OS可能是啟動其他病理機制所必需的，如Aβ和Tau蛋白誘導的神經毒性。此外，異常濃度的生物金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+)共定位于Aβ斑塊內，Aβ-Cu2+和Aβ-Fe2+/3+可以通過氧化還原循環誘導ROS的大量產生，進而加劇OS。基于ROS對蛋白沉積、生物金屬離子代謝失調和線粒體功能障礙的影響，清除或阻止ROS的形成可能有助于阻止AD的進展。

人們普遍認為，OS與神經炎癥是相互關聯的。在ROS的刺激下，過度產生促炎細胞因子并誘導神經炎癥。此外，慢性神經炎癥會加重DNA損傷、突觸功能障礙和Aβ負擔，導致加速認知衰退和神經元死亡。因此，抗氧化劑和抗神經炎劑的應用可能為對抗AD提供互補作用。

1.6 金屬離子穩態失衡 金屬離子穩態失衡是AD患者大腦的一個重要特征。Cu2+、Fe2+、Zn2+和Fe3+是4種最重要的生物金屬離子，它們的穩態失衡與AD的發病機制密切相關。Cu2+和Zn2+通過結合Aβ肽、影響Aβ聚集途徑來誘導產生有毒的Aβ低聚物，而氧化還原活性金屬Cu(Ⅰ/Ⅱ)和Fe(Ⅱ/Ⅲ)可通過Fenton反應引發OS并損傷神經元。因此，生物金屬螯合劑可以下調高水平的生物金屬，這可能是治療AD的一種潛在的治療策略。

1.7 MAO MAO是線粒體黃酮酶，由兩種亞型(MAO-A和MAO-B)組成。MAO可催化各種生物胺和異生物胺的氧化脫氨反應，并在AD和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等神經退行性疾病中發揮重要作用[33]。MAO-A抑制劑臨床上用于治療焦慮和抑郁癥，被認為是導致AD進展的危險因素，而MAO-B抑制劑用于治療PD。MAO抑制劑可增加單胺神經傳遞，減少ROS形成和OS，從而發揮抗氧化、神經保護和認知改善等作用，對AD的治療具有潛在的應用價值。

1.8 NMDA NMDA學說認為，作用于NMDA受體的谷氨酸刺激和谷氨酸相關興奮性毒性的最佳平衡對于治療AD至關重要。NMDA受體是一種離子型谷氨酸受體，由兩個NR1亞基和兩個NR2(NR2A-d)亞基或NR3亞基組成，當與興奮性神經遞質谷氨酸或調節劑甘氨酸結合時可被激活。NMDA受體在改變突觸的可塑性、學習和記憶形成以及在將短期記憶鞏固為長期記憶中起至關重要的作用[34]。而當NMDA受體被過量的谷氨酸過度刺激時，可導致谷氨酸相關的興奮性毒性和細胞死亡。

研究認為，膽堿能和谷氨酸能神經元系統可相互影響，NMDA受體的過度激活與AD患者膽堿能神經元的退行性過程有關，例如，直接將NMDA 注入大鼠基底前腦導致神經元衰退和皮質中膽堿乙酰轉移酶活性降低。因此，AChE和NMDA受體多靶點策略可以影響膽堿能和谷氨酸能系統，并協同拮抗神經退行性變。2015年批準由鹽酸美金剛和鹽酸多奈哌齊組成每日1次的固定劑量聯合藥物用于治療AD[35]。因此，同時靶向AChE和NMDA受體，可能是個很有前途的策略。

1.9 5-HT 5-HT在情緒和抑郁中具有重要的生理功能，且與神經退行性疾病認知功能中的膽堿能系統有關[36]。5-HT被認為是一種抑制性神經遞質。目前臨床上選擇性5-HT再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)以氟西汀和帕羅西汀為抗抑郁藥物代表。該類藥物通過抑制5-HT的神經元再攝取，增加突觸間隙的5-HT濃度，從而改善抑郁癥患者的情緒狀態。根據其結構和功能特征進行分類，5-HT受體有7種亞型(5-HT1～5-HT7受體)。大腦中的5-HT1A、5-HT4、5-HT6和5-HT7受體與學習和記憶有關。5-HT1A受體在重度抑郁癥的治療中起重要作用，應用該受體的激動劑和拮抗劑都可能是AD的潛在治療方法。如5-HT4受體參與記憶過程，該受體的部分激動劑可用于治療AD的認知癥狀。5-HT6受體主要表達于大腦皮層和海馬區，與學習和記憶過程相關，該受體的拮抗劑將有助于改善AD癥狀[37]。然而，目前靶向5-HT6抑制劑的研發卻困難重重。如靈北制藥的5-HT6受體拮抗劑Idalopirdine和Axovant公司的RVT-101，在臨床Ⅲ期研究中心因未改善輕至中度AD患者的認知而終止臨床實驗[38]。

1.10 H3受體 組胺能系統由組胺及其受體組成，在維持CNS的穩態方面發揮重要作用，并參與平滑肌收縮、毛細血管擴張、胃酸分泌和外周炎癥。組胺是一種分布在全身的內源性生物胺，在中樞作為神經遞質，在周圍作為局部介質，在肺、皮膚和胃腸道中濃度較高，并通過組胺受體發揮其生理功能。組胺受體是具有不同生物功能的G蛋白偶聯受體，有4種亞型，即H1、H2、H3和H4受體[39]。H3受體可負向調節組胺和一些與認知相關的神經遞質的釋放，如ACh、去甲腎上腺素、多巴胺和血清素。H3受體拮抗劑可增加大腦中ACh和其他神經遞質的含量，有利于對抗AD等神經退行性疾病[40]。

1.11 PDE 細胞內的第二信使環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)對于細胞活動起著重要的調節作用。PDE可水解cAMP和cGMP，從而終結其傳導所產生的生化作用。PDE有11個同工酶家族，從PDE1到PDE11，其中大多數有幾個亞型。根據目前的估計，人類總共有100個特定的PDE。在這些家族中，PDE4、PDE7和PDE8是cAMP水解的特異性酶，而PDE5、PDE6和PDE9是cGMP水解的特異性酶。PDE1、PDE2、PDE3、PDE10和PDE11是一種雙底物酶，可以同時水解cAMP和cGMP。具有降解第二信使能力的PDE，是神經可塑性和神經保護中信號轉導的重要調節因子。因此，具有上調cAMP和cGMP濃度能力的PDE抑制劑作為治療AD認知能力下降的潛在藥物越來越受關注[41]。長春西汀是一種用于治療癡呆和認知障礙的PDE1抑制劑，于1980年獲得批準，但據報道它對AD患者的認知障礙無效。大冢制藥公司的西洛他唑是一種口服PDE抑制劑，于1988年推出，用于改善各種慢性動脈阻塞癥狀，與多奈哌齊聯合治療輕中度AD。來自美國國家精神健康研究所的羅利普蘭是一種PDE4D抑制劑，Ⅱ期臨床試驗證實其在記憶鞏固中發揮了關鍵作用，用于治療重度抑郁癥。PDE5作為一種特殊的cGMP水解酶，只有一種亞型，即PDE5A，分布于大腦的海馬、皮質和小腦。PDE作為新的治療靶點，引起了眾多學者的廣泛關注，成為一個新的研究熱點，選擇性PDE4和PDE5抑制劑因分布在海馬而受到格外的重視[42]。

1.12 腦—腸軸—腸道菌群假說 腸道微生物群是人體腸道中的細菌、病毒和真菌共生系統，影響人體消化、腸道生物合成、新陳代謝和炎癥等生理過程。腸上皮屏障(intestinal epithelial barrier，IEB)是由單層上皮細胞構成黏膜界面，其功能是限制病原體和抗原的進入，為宿主提供生理和防御支持。腸血管屏障(gut-vascular barrier，GVB)由上皮細胞下方的細胞構成[43]，為第二道防線，起到控制抗原易位并阻止腸道微生物群進入的功能。腸道菌群失調可誘導IEB通透性改變，導致微生物代謝物的滲漏和外周炎癥，其產生的炎癥因子可穿過BBB激活小膠質細胞的過表達，導致神經炎癥和AD的進展。我國新近批準的一類新藥甘露特鈉膠囊(GV-971)通過重塑腸道菌群，降低異常代謝產物，阻止外周炎性向大腦浸潤，從而抑制神經炎癥和改善認知障礙[44]。

AD因具有復雜的發病機制和病理生理過程，導致其治療困難，并給患者及其家屬帶來沉重的負擔。因此，迫切需要研發有效的抗AD藥物。世界各地的研究小組為克服AD做出了巨大的努力，發現了許多與AD相關的靶點，并試圖解決這一科學難題。本綜述討論了12個與AD相關的機制學說，其中膽堿酯酶、BACE-1、GSK-3β、TREM2和CSF1R等成為研究的熱門靶點，載脂蛋白E(apolipoprotein E, APOE)因與基因攜帶相關，又與Aβ沉積、Tau蛋白沉積、神經炎癥以及線粒體功能和代謝等高度關聯，也頗具潛能[45]。新近研究發現，溶酶體的“酸化”障礙所致的神經元細胞死亡極可能是AD進展的全新機制[46]。隨著對AD疾病進展和分子機制的深入研究，開發通過多種作用機制抗AD的藥物值得期待。

2 多靶點導向的藥物研發策略

目前臨床上傳統的AD藥物主要分為膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏和石杉堿甲)和非競爭性NMDA拮抗劑(美金剛)。此外，2014年12月，食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準了治療AD的組合藥——Namzaric，該藥結合了鹽酸美金剛胺緩釋劑和鹽酸多奈哌齊，用于治療中重度AD。2019年11月，國家藥品監督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)有條件批準一類新藥甘露特鈉膠囊(GV-971)上市，用于臨床治療輕中度AD。2021年6月，FDA限制性批準靶向Aβ的單克隆抗體阿杜那單抗治療AD。然而，現有上市的藥物雖有一定程度的治療作用，但并不能阻止或逆轉疾病的進展，且存在一定的不良反應[47](表1)。

表1 目前抗AD上市藥物的作用靶點及局限性

AD是一種發病機制復雜、病理表現多樣的神經退行性疾病，但傳統的AD治療策略長期關注于“一個分子，一個靶點”的模式，很難改變AD的進展。近年來，多靶點定向配體(multi-target-directed ligand, MTDL)在AD治療中顯示出巨大的應用前景。

多靶點配體是將兩個或多個關鍵藥效團片段結合在一個分子里，這個分子與多個靶點均具有較好的親和力并產生多靶點活性[48]。因此，MDTL策略為病因復雜的神經退行性疾病開辟了新的治療途徑。目前有相當數量的多靶點抗AD的小分子化合物被研發出來，有望成為改善疾病的治療藥物。膽堿酯酶學說作為經典的AD學說，對AD藥物的研發具有積極的參考意義。世界各研究小組通過化學合成手段，設計合成一系列在靶向膽堿酯酶基礎上具有多靶點抗AD的類藥分子。

2018年，JIANG等[49]設計并合成了一類新的GSK-3β/AChE雙靶點抑制劑。其中，化合物1(圖3)在hAChE(IC50為6.5 nmol/L)和hGSK-3β激酶活性(IC50為66 nmol/L)方面顯示出納摩爾抑制作用。在20 μmol/L下，化合物1對Aβ自聚集顯示出良好的抑制作用(抑制率為46%)。蛋白質免疫印跡(Western-blot, WB)分析顯示，化合物1抑制小鼠神經母細胞瘤N2a Tau細胞中Tau蛋白的過度磷酸化。體內研究證實，化合物1能顯著改善東莨菪堿導致的ICR小鼠的認知障礙。SHARMA等[50]通過拼接多奈哌齊中的N-芐基哌啶藥效團，設計合成一系列5-苯基-1,3,4-口惡二唑多靶點衍生物，該類衍生物對hAChE、hBChE和β-分泌酶-1(hBACE-1)表現出較強的抑制作用，特別是化合物2(圖3)對所有靶標均表現出平衡的抑制特性。SANG等[51]通過拼接利凡斯的明和MAO抑制劑的藥效團，合成一系列新型鄰氨基甲酰亞鐵酰胺衍生物。體外生物學評價表明，化合物3(圖3)具有hBChE抑制(IC50為0.97 μmol/L)和選擇性MAO-B抑制作用(IC50為5.3 μmol/L)，對Aβ誘導的自聚和解聚具有較好的抑制作用，抑制率分別為58.2%和43.3%。體內研究表明，化合物3對三氯化鋁介導的斑馬魚運動障礙具有恢復作用，并對Aβ1-40引起的血管損傷具有顯著的保護作用。此外，化合物3可改善東莨膽堿誘導的認知障礙。LIU等[52]通過對多奈哌齊的藥效基團和天然來源的去氫駱駝蓬堿進行分子雜交，合成了一系列新型衍生物。研究發現，所有衍生物均具有顯著的抗AChE活性，且對BuChE具有良好的選擇性。化合物4(圖3)具有強大的抗AChE活性(IC50為0.27 μmol/L)、選擇性BuChE抑制活性(IC50為20.82 μmol/L)，以及GSK-3β抑制活性(IC50為6.78 μmol/L)。分子對接研究和分子動力學模擬結果表明，化合物4可以與AChE和GSK-3β形成穩定的相互作用。在Tau(P301L)293T細胞模型中，化合物4可有效降低Tau蛋白Ser396位點的過度磷酸化。此外，化合物4對SH-SY5Y、HEK-293T、HL-7702和HepG2細胞系表現出極低的細胞毒性。

圖3 基于多靶點策略設計的類藥分子

AD錯綜復雜的發病機制使多靶點治療藥物的研發不限于膽堿酯酶。表2匯總了部分不依賴膽堿酯酶、已進入臨床Ⅱ/Ⅲ期的多靶點治療AD的代表藥物。

表2 小分子抗AD藥物臨床研究進展

3 吡喃/啶酮骨架抗AD研究進展

雜環作為生命科學和生物化學之間的橋梁，為探索藥用分子提供了不同的化學空間，受到全球范圍內的極大關注。在這些雜環中，化合物5(羥基吡喃酮)及其電子等排體化合物6(羥基吡啶酮)是藥物設計和發現的重要骨架。例如化合物7(去鐵酮7)，是一種口服活性的3-羥基吡啶-4-酮衍生物，多年來臨床上一直用于鐵超載地中海貧血患者的鐵螯合劑[53](圖4)。

圖4 羥基吡喃酮、羥基吡啶酮和去鐵酮的化學結構

羥基吡喃酮/吡啶酮作為一類重要的含氧雜環核，具有廣泛的藥理活性，如抗癌、抗炎、抗氧化、金屬螯合、抗菌和抗真菌作用等，特別是其具有的抗氧化、抗炎和金屬螯合作用可有效對抗AD的發病進程。同時，羥基吡喃酮/吡啶酮骨架具有分子量小和可修飾位點多的特點，除了3位羥基和4位羰基是螯合金屬的必須基團外，其他環上2、5、6位都可以進行結構修飾，特別是1位的氧可以置換成氮、硫等雜原子，進一步促進其通過BBB[54](圖5)。此外，通過其他多樣性基團的引入，可以有效地改變其生物利用度、化合物的理化性質和生物特性，并可以通過拼接、融合等其他抗AD的活性基團，設計合成具有多種抗AD作用的類藥分子，因此，羥基吡喃/吡啶酮在多靶點抗AD中的藥物設計中具有極大的發展潛能。

圖5 吡喃酮骨架的活性與結構優勢

白藜蘆醇是一種天然存在的二苯乙烯類化合物，由于其具有抑制Aβ聚集和清除自由基等多種功能，目前已作為抗AD藥物進入臨床試驗。CHENG等[55]將3-羥基吡喃-4-酮的結構融入白藜蘆醇中，得到一系列白藜蘆醇雜交體作為新型多靶點化合物。體外生物學評價表明，這些化合物具有抑制自誘導的Aβ1-42聚集、抗氧化和金屬螯合活性。其中，化合物8(圖6)對ABTS+自由基的清除活性強于維生素E類似物Trolox，對Aβ1-42聚集呈現微摩爾級別的抑制[IC50為(7.20±0.72)μmol/L]，優于陽性對照物白藜蘆醇[IC50為(11.89±2.52)μmol/L]。羥基吡喃酮基團的引入，賦予化合物8良好的金屬螯合活性，可有效對抗Fe3+和Cu2+誘導的Aβ聚集。HU等[40]采用藥效團結合策略，設計并合成一系列新型的2-苯乙烯基-5-羥基-4-吡喃酮衍生物，作為MTDL來治療AD。化合物9(圖6)在保留苯氧烷基胺骨架具備的H3受體拮抗作用(IC50為8.25 nmol/L)的同時，也呈現出羥基吡喃酮骨架所具備的優秀的金屬離子螯合能力，比Trolox更強大的ABTS+清除能力以及高效Aβ自聚和Cu2+誘導的聚集抑制作用以及對Aβ自聚/Cu2+誘導聚集的分解能力。DGACHI等[56]基于曲酸和他克林的藥效團設計合成一系列衍生物，其中化合物10(圖6)，得益于羥基吡喃酮骨架的貢獻，具有強大的抗氧化能力(TE為4.79)，并對Aβ1-40誘導的SH-SY5Y具有顯著的神經保護作用。同時，經過結構修飾，化合物10的肝毒性低于他克林，并呈現出中等的AChEI[IC50為(4.52±0.24)μmol/L]。XU等[57]采用了藥效團組合策略，設計合成了一系列去鐵酮-白藜蘆醇雜交體，評價其多功能抗AD的作用。體外生物活性評價表明，大部分化合物對Aβ1-42自誘導聚集具有較好的抑制作用，且具有較強的金屬螯合能力和抗氧化活性。化合物11(圖6)繼承了羥基吡啶酮具有的ABTS+清除活性和金屬螯合作用，還呈現出優于白藜蘆醇的抑制Aβ1-42聚集[IC50為(10.72±0.5)μmol/L]作用。對接研究表明，化合物11可以與Aβ1-42蛋白的C端形成氫鍵發生相互作用。

香豆素作為MAO-B抑制劑的優勢骨架，目前已被廣泛研究。ZHANG等[58]設計合成一系列羥基吡啶酮和香豆素的衍生物，表現出優異的鐵離子螯合作用和中等至良好的抗MAO-B活性。化合物12(圖6)對MAO-B表現出較好的抑制作用(IC50為14.7 nmol/L)，優于陽性對照藥帕吉林(IC50為85.8 nmol/L)。同時，對U251細胞具有良好的保護作用，可顯著改善東莨菪堿誘導的AD小鼠的認知功能障礙。與之類似，JIANG等[59]通過將羥基吡啶酮與香豆素結合，設計了新的雜交種，所有化合物均繼承了母體化合物所具備的MAO-B的抑制活性和鐵螯合活性。化合物13(圖6)對MAO-B抑制作用的IC50為87.9 nmol/L，對Aβ1-42誘導的PC12細胞損傷具有細胞保護作用。Morris水迷宮測試顯示，化合物13顯著改善了小鼠的認知障礙。MI等[60]以香豆素和羥基吡啶酮為先導化合物，通過整合關鍵藥效團設計合成了一系列雙靶點雜交體，其中化合物14(圖6)在保留羥基吡啶酮良好的鐵離子螯合活性的基礎上，具有優秀的MAO-B抑制活性(IC50為0.68 μmol/L)。BORTOLAMI等[61]設計了一系列去鐵酮衍生物作為AD的潛在多功能化合物15(圖6)，其將去鐵酮結構和2-氨基吡啶、2-氨基嘧啶或2,4-二氨基嘧啶等具有膽堿酯酶抑制活性基團用長烷烴鏈連接，以獲得具有抑制膽堿酯酶、抑制Aβ聚集、螯合金屬等多種活性。此外，該類化合物對于人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U-87MG)具有較低的毒性。SHENG等[62]通過將3-羥基-4-吡啶酮和H3受體拮抗劑進行雜交，設計合成了一系列新型的1-苯基-3-羥基-4-吡啶衍生物。化合物16(圖6)具有優于陽性對照物姜黃素的納摩爾級別的H3受體拮抗作用[IC50為(2.85±0.22)nmol/L]，并能有效阻斷Aβ1-42原纖維的形成，具有良好的銅和鐵螯合性能，以及較好的自由基離子清除活性。此外，體內試驗研究表明，化合物16在0.5 h內腦內濃度達到207 ng/mL，腦/血漿暴露比為0.69，說明該化合物能夠過BBB，這對于CNS的藥物來說，極其關鍵。

圖6 基于吡喃酮及類似結構的多靶點抗AD潛力化合物

綜上所述，通過合理的引入吡喃/啶酮及類似結構，可成為多功能抗AD小分子的優選結構。通過設計合成全新的吡喃/啶酮化合物，并對其進行活性評價和構效關系研究，為含有吡喃/啶酮母核的衍生物開發成具有抗AD的類藥分子提供了參考依據。

在過去的10 a，多靶點藥物發現策略在神經退行性疾病、癌癥或心血管疾病等復雜疾病的藥物研發中具有很大的潛力。AD的一個獨特而復雜的特征就是不同信號通路中的相關靶點可發生相互作用，并形成一個疾病網絡。考慮到AD的復雜的發病機制和單靶點藥物的缺點，多靶點藥物相對于單靶點藥物，能夠有效協同多個靶標，從而更好地影響疾病網絡和控制AD進展。因此，多靶點設計策略是當前AD治療研究的一個重要方向。然而，MTDL的設計也給藥物化學家在優化活性和理化性質方面提出了一些挑戰，特別是MTDL設計的化合物要求對每個靶標都有較好的作用，而在許多情況下，達到相似的效力(即調控兩個靶點在相同濃度范圍內)是一項具有挑戰性的任務。此外，由于MTDL在大多數情況下是通過整合兩個或更多選擇性配體的結構元素而設計的，分子量比大多數商業藥物更大、親脂性也更強，因此可能導致口服吸收不良。另一方面，在AD等CNS疾病相關的藥物發現過程中，另一個挑戰是克服BBB。分子量(MW)、親脂性(logP)、極性表面積(PSA)以及與P-糖蛋白外排轉運體(P-gp)的相互作用都會影響分子對BBB的滲透能力。一般認為，分子量<450、PSA<90 ?2的藥物具有較好的血腦通透性[63]，而羥基吡喃酮/吡啶酮具有分子量小、PSA小以及結構易修飾的優點，使其在神經退行性疾病的藥物設計中值得探索。隨著計算機輔助藥物設計在新藥研發中的助力，可進一步發掘以羥基吡喃酮/吡啶酮為骨架的療效更好、生物利用度更佳的多靶點抗AD的候選藥物分子，以加快AD藥物的研發。